Transportador de cassete de ligação de ATP - ATP-binding cassette transporter

ABC Transporter, NBD
Transportador de vitamina B 12 , BtuCD PDB 1l7v
Identificadores
Símbolo	ABC_tran
Pfam	PF00005
InterPro	IPR003439
PRÓSITO	PDOC00185
SCOP2	1b0u / SCOPe / SUPFAM
TCDB	3.A.1
Superfamília OPM	17
Proteína OPM	3g5u
Estruturas de proteínas disponíveis: Pfam   estruturas / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum resumo da estrutura

Lipid flippase MsbA

Complexo do transportador de molibdato AB ₂ C ₂ , estado aberto

Os transportadores de cassete de ligação de ATP ( transportadores ABC ) são uma superfamília de sistemas de transporte que é uma das maiores e possivelmente uma das mais antigas famílias de genes . É representado em todos os filos existentes , de procariontes a humanos .

Os transportadores ABC frequentemente consistem em múltiplas subunidades, uma ou duas das quais são proteínas transmembrana e uma ou duas das quais são AAA ATPases associadas à membrana . As subunidades ATPase utilizam a energia de ligação e hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) para fornecer a energia necessária para a translocação de substratos através das membranas, seja para absorção ou exportação do substrato.

A maioria dos sistemas de captação também possui um receptor extracitoplasmático, uma proteína de ligação ao soluto. Algumas ATPases homólogas funcionam em processos não relacionados ao transporte, como tradução de RNA e reparo de DNA . Os transportadores ABC são considerados uma superfamília ABC com base nas semelhanças da sequência e organização de seus domínios de cassete de ligação de ATP (ABC), embora as proteínas integrais de membrana pareçam ter evoluído independentemente várias vezes e, portanto, compreendam diferentes famílias de proteínas. Como os exportadores ABC, é possível que as proteínas integrais de membrana dos sistemas de captação ABC também tenham evoluído pelo menos 3 vezes de forma independente, com base em suas estruturas tridimensionais de alta resolução. Os porters de absorção ABC absorvem uma grande variedade de nutrientes, precursores biossintéticos, traços de metais e vitaminas , enquanto os exportadores transportam lipídios , esteróis , drogas e uma grande variedade de metabólitos primários e secundários. Alguns desses exportadores em humanos estão envolvidos na resistência a tumores, fibrose cística e uma série de outras doenças humanas hereditárias. A expressão de alto nível dos genes que codificam alguns desses exportadores em organismos procarióticos e eucarióticos (incluindo humanos) resulta no desenvolvimento de resistência a vários medicamentos, como antibióticos e agentes anticâncer.

Centenas de transportadores ABC foram caracterizados tanto de procariotos quanto de eucariotos. Os genes ABC são essenciais para muitos processos na célula e as mutações nos genes humanos causam ou contribuem para várias doenças genéticas humanas. Quarenta e oito genes ABC foram relatados em humanos. Entre eles, muitos foram caracterizados e demonstraram estar causalmente relacionados a doenças presentes em humanos, como fibrose cística , adrenoleucodistrofia , doença de Stargardt , tumores resistentes a medicamentos, síndrome de Dubin-Johnson , doença de Byler, colestase intra-hepática familiar progressiva, sideroblástica ligada ao X anemia , ataxia e hipoglicemia persistente e hiperinsulimênica. Os transportadores ABC também estão envolvidos na resistência a múltiplos medicamentos , e foi assim que alguns deles foram identificados pela primeira vez. Quando as proteínas de transporte ABC são superexpressas nas células cancerosas, elas podem exportar drogas anticâncer e tornar os tumores resistentes.

Função

Os transportadores ABC utilizam a energia de ligação e hidrólise do ATP para transportar vários substratos através das membranas celulares . Eles são divididos em três categorias funcionais principais. Em procariotos, os importadores medeiam a absorção de nutrientes pela célula. Os substratos que podem ser transportados incluem íons , aminoácidos , peptídeos , açúcares e outras moléculas que são principalmente hidrofílicas . A região que atravessa a membrana do transportador ABC protege os substratos hidrofílicos dos lipídios da bicamada da membrana , proporcionando assim um caminho através da membrana celular. Os eucariotos não possuem importadores. Exportadores ou efluxadores , que estão presentes tanto em procariotos quanto em eucariotos, funcionam como bombas que expelem toxinas e drogas para fora da célula. Em bactérias gram-negativas , os exportadores transportam lipídios e alguns polissacarídeos do citoplasma para o periplasma . O terceiro subgrupo de proteínas ABC não funciona como transportador, mas está envolvido nos processos de tradução e reparo do DNA.

Procariota

Os transportadores bacterianos ABC são essenciais para a viabilidade, virulência e patogenicidade das células . Os sistemas de captação de ferro ABC, por exemplo, são importantes efetores de virulência. Os patógenos usam sideróforos , como a Enterobactina , para eliminar o ferro que está em complexo com proteínas ou eritrócitos de alta afinidade de ligação ao ferro . Estas são moléculas quelantes de ferro de alta afinidade que são secretadas por bactérias e reabsorvem ferro em complexos de ferro-sideróforo. O gene chvE-gguAB em Agrobacterium tumefaciens codifica importadores de glicose e galactose que também estão associados à virulência. Os transportadores são extremamente vitais para a sobrevivência celular, de modo que funcionam como sistemas de proteínas que neutralizam qualquer mudança indesejável que ocorra na célula. Por exemplo, um aumento potencial letal na força osmótica é contrabalançado pela ativação de transportadores ABC osmossensores que medeiam a absorção de solutos. Além de funcionar no transporte, algumas proteínas ABC bacterianas também estão envolvidas na regulação de vários processos fisiológicos.

Em sistemas de efluxo bacteriano, certas substâncias que precisam ser extrudadas da célula incluem componentes de superfície da célula bacteriana (por exemplo, polissacarídeos capsulares, lipopolissacarídeos e ácido teicóico ), proteínas envolvidas na patogênese bacteriana (por exemplo , hemólise , proteína de ligação ao heme e alcalina protease ), heme, enzimas hidrolíticas , proteínas da camada S, fatores de competência, toxinas , antibióticos , bacteriocinas , antibióticos peptídicos , drogas e sideróforos. Eles também desempenham papéis importantes nas vias biossintéticas, incluindo a biossíntese de polissacarídeos extracelulares e a biogênese do citocromo .

Eucariótica

Embora a maioria dos transportadores ABC eucarióticos sejam efluxadores, alguns não estão diretamente envolvidos no transporte de substratos. No regulador transmembrana da fibrose cística ( CFTR ) e no receptor de sulfonilureia (SUR), a hidrólise do ATP está associada à regulação da abertura e fechamento dos canais iônicos carregados pela própria proteína ABC ou por outras proteínas.

Os transportadores humanos ABC estão envolvidos em várias doenças que surgem de polimorfismos nos genes ABC e raramente devido à perda completa da função de proteínas ABC individuais. Tais doenças incluem Mendelian doenças e desordens genéticas complexas, tais como a fibrose cística, a adrenoleucodistrofia , doença de Stargardt , doença de Tangier , deficiências imunológicas, intraheptic familiar progressiva colestase , síndrome de Dubin-Johnson , pseudoxantoma elasticum , persistente hipoglicemia hiperinsulinêmica de infância devido a adenomatosa focal hiperplasia , X -Conectado sideroblastosis e anemia , a idade relacionada com a degeneração macular , hypoapoproteinemia familiar, retinite pigmentosa, cone distrofia haste , e outros. A família humana ABCB (MDR / TAP) é responsável pela resistência múltipla a drogas (MDR) contra uma variedade de drogas estruturalmente não relacionadas. A glicoproteína P ABCB1 ou MDR1 também está envolvida em outros processos biológicos para os quais o transporte de lipídios é a função principal. É encontrado para mediar a secreção do esteroide aldosterona pelas adrenais, e sua inibição bloqueou a migração de células imunes dendríticas , possivelmente relacionada ao transporte para fora do fator ativador de plaquetas lipídicas (PAF). Também foi relatado que ABCB1 medeia o transporte de cortisol e dexametasona , mas não de progesterona em células transfectadas com ABCB1. O MDR1 também pode transportar colesterol , análogos de cadeia curta e de cadeia longa de fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), esfingomielina (SM) e glucosilceramida (GlcCer). O transporte multiespecífico de diversos lipídios endógenos através do transportador MDR1 pode possivelmente afetar a distribuição transbilayer de lipídios, em particular de espécies normalmente predominantes no folheto da membrana plasmática interna, como PS e PE.

Mais recentemente, foi demonstrado que os transportadores ABC existem dentro da placenta , indicando que podem desempenhar um papel protetor para o feto em desenvolvimento contra os xenobióticos .

Estrutura

Estrutura de um importador ABC: BtuCD com proteína de ligação ( PDB : 2qi9 )

Estrutura de um exportador ABC: Sav1866 com nucleotídeo ligado ( PDB : 2onj )

Todas as proteínas de transporte ABC compartilham uma organização estrutural que consiste em quatro domínios principais. Esses domínios consistem em dois domínios transmembranares (T) e dois domínios citosólicos (A). Os dois domínios T alternam entre uma orientação voltada para dentro e para fora, e a alternância é alimentada pela hidrólise de trifosfato de adenosina ou ATP . O ATP se liga às subunidades A e é então hidrolisado para alimentar a alternância, mas o processo exato pelo qual isso acontece não é conhecido. Os quatro domínios podem estar presentes em quatro polipeptídeos separados , que ocorrem principalmente em bactérias, ou presentes em um ou dois polipeptídeos de múltiplos domínios . Quando os polipeptídeos são um domínio, eles podem ser referidos como um domínio completo e, quando são dois multi-domínios, podem ser chamados de meio domínio. Cada um dos domínios T é constituído de 10 hélices alfa abrangendo a membrana, através das quais a substância transportada pode atravessar a membrana plasmática . Além disso, a estrutura dos domínios T determina a especificidade de cada proteína ABC. Na conformação voltada para dentro, o sítio de ligação no domínio A é aberto diretamente para as soluções aquosas circundantes. Isso permite que as moléculas hidrofílicas entrem no local de ligação diretamente do folheto interno da bicamada fosfolipídica . Além disso, uma lacuna na proteína é acessível diretamente do núcleo hidrofóbico do folheto interno da bicamada da membrana. Isso permite que as moléculas hidrofóbicas entrem no local de ligação diretamente do folheto interno da bicamada fosfolipídica . Depois que o ATP alimentado se move para a conformação voltada para fora, as moléculas são liberadas do local de ligação e podem escapar para o folheto exoplasmático ou diretamente para o meio extracelular .

A característica comum de todos os transportadores ABC é que eles consistem em dois domínios distintos, o domínio transmembranar (TMD) e o domínio de ligação a nucleotídeos (NBD) . O TMD, também conhecido como domínio de abrangência de membrana (MSD) ou domínio de membrana integral (IM), consiste em hélices alfa , embutidas na bicamada da membrana. Ele reconhece uma variedade de substratos e passa por mudanças conformacionais para transportar o substrato através da membrana. A sequência e a arquitetura dos TMDs são variáveis, refletindo a diversidade química dos substratos que podem ser translocados. O domínio NBD ou cassete de ligação de ATP (ABC), por outro lado, está localizado no citoplasma e possui uma sequência altamente conservada. O NBD é o local para a ligação do ATP. Na maioria dos exportadores, o domínio transmembranar do terminal N e os domínios ABC do terminal C são fundidos como uma única cadeia polipeptídica, organizada como TMD-NBD-TMD-NBD. Um exemplo é o exportador de hemolisina de E. coli HlyB. Os importadores possuem uma organização invertida, ou seja, NBD-TMD-NBD-TMD, onde o domínio ABC é N-terminal enquanto o TMD é C-terminal, como na proteína MacB de E. coli responsável pela resistência aos macrolídeos .

A arquitetura estrutural dos transportadores ABC consiste no mínimo em dois TMDs e dois NBDs. Quatro cadeias polipeptídicas individuais, incluindo duas subunidades TMD e duas NBD, podem se combinar para formar um transportador completo , como no importador E. coli BtuCD envolvido na absorção de vitamina B ₁₂ . A maioria dos exportadores, como no exportador de múltiplas drogas Sav1866 de Staphylococcus aureus , são constituídos por um homodímero que consiste em dois meios transportadores ou monômeros de um TMD fundido a um domínio de ligação de nucleotídeo (NBD). Freqüentemente, é necessário um transportador completo para obter funcionalidade. Alguns transportadores ABC possuem elementos adicionais que contribuem para a função reguladora dessa classe de proteínas. Em particular, os importadores têm uma proteína de ligação de alta afinidade (BP) que se associa especificamente com o substrato no periplasma para entrega ao transportador ABC apropriado. Os exportadores não têm a proteína de ligação, mas têm um domínio intracelular (ICD) que se junta às hélices que abrangem a membrana e ao domínio ABC. Acredita-se que o CID seja responsável pela comunicação entre o TMD e o NBD.

Domínio transmembrana (TMD)

A maioria dos transportadores possui domínios transmembranares que consistem em um total de 12 hélices α com 6 hélices α por monômero. Uma vez que os TMDs são estruturalmente diversos, alguns transportadores têm um número variável de hélices (entre seis e onze). Os domínios TM são categorizados em três conjuntos distintos de dobras: importador ABC tipo I , importador ABC tipo II e dobras exportador ABC . A classificação das dobras do importador é baseada na caracterização detalhada das sequências.

A dobra do importador ABC do tipo I foi observada originalmente na subunidade ModB TM do transportador de molibdato . Esta dobra diagnóstica também pode ser encontrada nas subunidades MalF e MalG TM de MalFGK ₂ e no transportador MetI de Met. No transportador MetI, um conjunto mínimo de 5 hélices transmembranares constitui esta dobra, enquanto uma hélice adicional está presente para ModB e MalG. A organização comum da dobra é a topologia "de cima para baixo" das hélices TM2-5 que alinha a via de translocação e a hélice TM1 enrolada ao redor da superfície externa voltada para a membrana e contata as outras hélices TM.

A dobra do importador ABC do tipo II é observada no domínio da hélice de vinte TM de BtuCD e em Hi1471, um transportador homólogo de Haemophilus influenzae . No BtuCD, o empacotamento das hélices é complexo. O padrão perceptível é que a hélice do TM2 é posicionada no centro da subunidade, onde é cercada em estreita proximidade pelas outras hélices. Enquanto isso, as hélices TM5 e TM10 são posicionadas na interface TMD. A região de abrangência da membrana dos exportadores ABC é organizada em duas "asas" que são compostas por hélices TM1 e TM2 de uma subunidade e TM3-6 da outra, em um arranjo de troca de domínio. Um padrão proeminente é que as hélices TM1-3 estão relacionadas ao TM4-6 por uma rotação dupla aproximada em torno de um eixo no plano da membrana.

A dobra do exportador é observada originalmente na estrutura Sav1866. Ele contém 12 hélices TM, 6 por monômero.

Domínio de ligação de nucleotídeo (NBD)

Estrutura do NBD de transportadores ABC com nucleotídeo ligado ( PDB : 2onj ). A representação linear da sequência de proteínas acima mostra as posições relativas dos motivos de aminoácidos conservados na estrutura (as cores correspondem à estrutura 3D)

O domínio ABC consiste em dois domínios, o domínio do núcleo catalítico semelhante às ATPases motoras semelhantes a RecA e um subdomínio α-helicoidal menor e estruturalmente diverso que é exclusivo dos transportadores ABC. O domínio maior consiste tipicamente em duas folhas β e seis hélices α, onde o motivo catalítico Walker A (GXXGXGKS / T onde X é qualquer aminoácido) ou P-loop e motivo Walker B (ΦΦΦΦD, do qual Φ é um resíduo hidrofóbico ) é situado. O domínio helicoidal consiste em três ou quatro hélices e o motivo de assinatura ABC , também conhecido como motivo LSGGQ , peptídeo de ligação ou motivo C. O domínio ABC também possui um resíduo de glutamina residindo em um loop flexível chamado loop Q , tampa ou switch γ-fosfato, que conecta o TMD e ABC. Presume-se que o loop Q esteja envolvido na interação do NBD e do TMD, particularmente no acoplamento da hidrólise de nucleotídeos às mudanças conformacionais do TMD durante a translocação do substrato. O motivo H ou região de troca contém um resíduo de histidina altamente conservado que também é importante na interação do domínio ABC com ATP. O nome cassete de ligação de ATP é derivado do arranjo diagnóstico das dobras ou motivos desta classe de proteínas após a formação do sanduíche de ATP e hidrólise de ATP.

Ligação e hidrólise de ATP

A formação de dímero dos dois domínios ABC de transportadores requer ligação de ATP. É geralmente observado que o estado ligado ao ATP está associado à interface mais extensa entre os domínios ABC, enquanto as estruturas dos transportadores livres de nucleotídeos exibem conformações com maiores separações entre os domínios ABC. Estruturas do estado ligado a ATP de NBDs isolados foram relatadas para importadores, incluindo HisP, GlcV, MJ1267, E. coli MalK (EcMalK), T. litoralis MalK (TlMalK) e exportadores, como TAP, HlyB, MJ0796, Sav1866, e MsbA. Nestes transportadores, o ATP está ligado ao domínio ABC. Duas moléculas de ATP estão posicionadas na interface do dímero, intercaladas entre o motivo Walker A de uma subunidade e o motivo LSGGQ da outra. Isso foi observado pela primeira vez em Rad50 e relatado em estruturas de MJ0796, a subunidade NBD do transportador LolD de Methanococcus jannaschii e EcMalK de um transportador de maltose. Essas estruturas também foram consistentes com os resultados de estudos bioquímicos revelando que o ATP está em contato próximo com resíduos no P-loop e motivo LSGGQ durante a catálise .

A ligação de nucleotídeos é necessária para garantir a integridade eletrostática e / ou estrutural do sítio ativo e contribuir para a formação de um dímero NBD ativo. A ligação de ATP é estabilizada pelas seguintes interações: (1) interação de empilhamento de anel de um resíduo aromático conservado precedendo o motivo Walker A e o anel de adenosina de ATP, (2) ligações de hidrogênio entre um resíduo de lisina conservado no motivo Walker A e os átomos de oxigênio dos β- e γ-fosfatos de ATP e coordenação desses fosfatos e alguns resíduos no motivo Walker A com íon Mg ²⁺ , e (3) coordenação γ-fosfato com cadeia lateral de grupos serina e amida de base de resíduos de glicina no motivo LSGGQ. Além disso, um resíduo que sugere o forte acoplamento da ligação e dimerização do ATP é a histidina conservada no H-loop. Esta histidina contata resíduos através da interface do dímero no motivo Walker A e no loop D, uma sequência conservada seguindo o motivo Walker B.

A hidrólise enzimática do ATP requer a ligação adequada dos fosfatos e o posicionamento do γ-fosfato na água de ataque. No sítio de ligação do nucleotídeo, os átomos de oxigênio dos β- e γ-fosfatos de ATP são estabilizados por resíduos no motivo Walker A e coordenam com Mg ²⁺ . Este íon Mg ²⁺ também se coordena com o resíduo de aspartato terminal no motivo Walker B através do ataque H ₂ O. Uma base geral, que pode ser o resíduo de glutamato adjacente ao motivo Walker B, glutamina no Q-loop, ou um histidina na região de troca que forma uma ligação de hidrogênio com o γ-fosfato de ATP, catalisa a taxa de hidrólise de ATP, promovendo o ataque de H ₂ O. O mecanismo molecular preciso da hidrólise de ATP ainda é controverso.

Mecanismo de transporte

Os transportadores ABC são transportadores ativos , ou seja, usam energia na forma de trifosfato de adenosina (ATP) para translocar substratos através das membranas celulares. Essas proteínas aproveitam a energia de ligação e / ou hidrólise do ATP para conduzir mudanças conformacionais no domínio transmembrana (TMD) e, conseqüentemente, transportar moléculas. Os importadores e exportadores ABC têm um mecanismo comum para transportar substratos. Eles são semelhantes em suas estruturas. O modelo que descreve as mudanças conformacionais associadas à ligação do substrato é o modelo de acesso alternado . Neste modelo, o local de ligação do substrato alterna entre conformações voltadas para fora e para dentro . As afinidades de ligação relativas das duas conformações para o substrato determinam amplamente a direção do transporte. Para importadores, uma vez que a translocação é direcionada do periplasma para o citoplasma, a conformação voltada para fora tem maior afinidade de ligação para o substrato. Em contraste, a afinidade de ligação ao substrato nos exportadores é maior na conformação voltada para dentro. Um modelo que descreve as mudanças conformacionais no domínio de ligação de nucleotídeos (NBD) como resultado da ligação e hidrólise de ATP é o modelo de troca de ATP . Este modelo apresenta duas conformações principais dos NBDs: formação de um dímero fechado ao ligar duas moléculas de ATP e dissociação em um dímero aberto facilitada pela hidrólise de ATP e liberação de fosfato inorgânico (P _i ) e difosfato de adenosina (ADP). Alternar entre as conformações de dímero aberto e fechado induz mudanças conformacionais no TMD, resultando na translocação do substrato.

O mecanismo geral para o ciclo de transporte de transportadores ABC não foi totalmente elucidado, mas dados estruturais e bioquímicos substanciais foram acumulados para apoiar um modelo no qual a ligação de ATP e hidrólise é acoplada a mudanças conformacionais no transportador. O estado de repouso de todos os transportadores ABC tem os NBDs em uma configuração de dímero aberto, com baixa afinidade para ATP. Esta conformação aberta possui uma câmara acessível ao interior do transportador. O ciclo de transporte é iniciado pela ligação do substrato ao sítio de alta afinidade nos TMDs, o que induz mudanças conformacionais nos NBDs e aumenta a ligação do ATP. Duas moléculas de ATP se ligam, cooperativamente, para formar a configuração de dímero fechada. O dímero NBD fechado induz uma mudança conformacional nos TMDs de tal forma que o TMD abre, formando uma câmara com uma abertura oposta àquela do estado inicial. A afinidade do substrato para o TMD é reduzida, liberando assim o substrato. Segue-se a hidrólise do ATP e, em seguida, a liberação sequencial de P _i e, em seguida, o ADP restaura o transportador à sua configuração basal. Embora um mecanismo comum tenha sido sugerido, a ordem de ligação do substrato, ligação e hidrólise de nucleotídeos e mudanças conformacionais, bem como as interações entre os domínios, ainda são debatidos.

Vários grupos que estudam os transportadores ABC têm diferentes suposições sobre a força motriz da função do transportador. É geralmente assumido que a hidrólise do ATP fornece a principal entrada de energia ou "golpe de potência" para o transporte e que os NBDs operam alternadamente e estão possivelmente envolvidos em diferentes etapas no ciclo de transporte. No entanto, dados estruturais e bioquímicos recentes mostram que a ligação do ATP, ao invés da hidrólise do ATP, fornece o "golpe de força". Também pode ser que, uma vez que a ligação de ATP desencadeia a dimerização de NBD, a formação do dímero pode representar o "golpe de força". Além disso, alguns transportadores têm NBDs que não têm habilidades semelhantes na ligação e hidrólise de ATP e que a interface do dímero NBD consiste em dois bolsos de ligação de ATP sugere uma função simultânea dos dois NBDs no ciclo de transporte.

Algumas evidências para mostrar que a ligação de ATP é de fato o golpe de força do ciclo de transporte foram relatadas. Foi demonstrado que a ligação de ATP induz mudanças nas propriedades de ligação de substrato dos TMDs. A afinidade dos transportadores ABC por substratos tem sido difícil de medir diretamente, e as medições indiretas, por exemplo, por meio da estimulação da atividade de ATPase, frequentemente refletem outras etapas de limitação da taxa. Recentemente, a medição direta da ligação de vinblastina à glicoproteína- permease ( glicoproteína-P ) na presença de análogos de ATP não hidrolisáveis, por exemplo, 5'-adenilil-β-γ-imidodifosfato (AMP-PNP), mostrou que a ligação de ATP, na ausência de hidrólise, é suficiente para reduzir a afinidade de ligação ao substrato. Além disso, a ligação de ATP induz mudanças conformacionais substanciais nos TMDs. Estudos espectroscópicos , de acessibilidade de protease e de reticulação demonstraram que a ligação de ATP aos NBDs induz alterações conformacionais na proteína-1 associada à resistência a múltiplas drogas (MRP1), HisPMQ, LmrA e Pgp. As estruturas cristalinas bidimensionais de Pgp ligada a AMP-PNP mostraram que a principal mudança conformacional durante o ciclo de transporte ocorre após a ligação de ATP e que a hidrólise de ATP subsequente introduz mudanças mais limitadas. A rotação e a inclinação das hélices α transmembrana podem contribuir para essas mudanças conformacionais. Outros estudos se concentraram em confirmar que a ligação de ATP induz a formação de dímero fechado de NBD. Estudos bioquímicos de complexos de transporte intactos sugerem que as mudanças conformacionais nos NBDs são relativamente pequenas. Na ausência de ATP, os NBDs podem ser relativamente flexíveis, mas não envolvem uma grande reorientação dos NBDs em relação aos outros domínios. A ligação de ATP induz uma rotação de corpo rígido dos dois subdomínios ABC em relação um ao outro, o que permite o alinhamento adequado do nucleotídeo no sítio ativo e a interação com os motivos designados. Há fortes evidências bioquímicas de que a ligação de duas moléculas de ATP pode ser cooperativa, ou seja, o ATP deve se ligar aos dois bolsos do sítio ativo antes que os NBDs possam dimerizar e formar a conformação fechada cataliticamente ativa.

Importadores ABC

A maioria dos transportadores ABC que medeiam a absorção de nutrientes e outras moléculas em bactérias dependem de uma proteína de ligação de soluto (BP) de alta afinidade. BPs são proteínas solúveis localizadas no espaço periplasmático entre as membranas interna e externa de bactérias gram-negativas . Os microrganismos Gram-positivos não têm um periplasma, de modo que sua proteína de ligação é freqüentemente uma lipoproteína ligada à face externa da membrana celular . Algumas bactérias gram-positivas têm BPs fundidos ao domínio transmembrana do próprio transportador. A primeira estrutura cristalina de raios-X bem - sucedida de um importador ABC intacto é o transportador de molibdênio (ModBC-A) de Archaeoglobus fulgidus . Estruturas de resolução atômica de três outros importadores de bactérias, E. coli BtuCD, transportador de maltose de E. coli (MalFGK ₂ -E) e o transportador de quelato de metal putativo de Haemophilus influenzae , HI1470 / 1, também foram determinadas. As estruturas forneceram imagens detalhadas da interação dos domínios transmembrana e ABC, bem como revelaram duas conformações diferentes com uma abertura em duas direções opostas. Outra característica comum dos importadores é que cada NBD está ligado a um TMD principalmente por meio de uma curta hélice citoplasmática do TMD, a "hélice de acoplamento". Esta porção do loop EAA acopla em uma fenda de superfície formada entre os subdomínios ABC semelhante a RecA e helicoidal e fica aproximadamente paralela à bicamada da membrana.

Grandes importadores ABC

O BtuCD e o HI1470 / 1 são classificados como grandes importadores ABC (Tipo II). A subunidade transmembrana do importador de vitamina B ₁₂ , BtuCD, contém 10 hélices TM e a unidade funcional consiste em duas cópias de cada um do domínio de ligação de nucleotídeo (NBD) e domínio transmembrana (TMD). O TMD e o NBD interagem um com o outro através do loop citoplasmático entre duas hélices TM e o loop Q no ABC. Na ausência de nucleotídeo, os dois domínios ABC são dobrados e a interface do dímero é aberta. Uma comparação das estruturas com (BtuCDF) e sem (BtuCD) proteína de ligação revela que BtuCD tem uma abertura voltada para o periplasma, enquanto que em BtuCDF, a conformação voltada para fora é fechada em ambos os lados da membrana. As estruturas do BtuCD e do homólogo do BtuCD, HI1470 / 1, representam dois estados conformacionais diferentes de um transportador ABC. A via de translocação prevista em BtuCD é aberta para o periplasma e fechada no lado citoplasmático da membrana, enquanto a de HI1470 / 1 está voltada para a direção oposta e aberta apenas para o citoplasma. A diferença nas estruturas é uma torção de 9 ° de uma subunidade TM em relação à outra.

Pequenos importadores ABC

As estruturas do ModBC-A e MalFGK ₂ -E, que estão em complexo com a sua proteína de ligação, correspondem a pequenos importadores ABC (Tipo I). Os TMDs de ModBC-A e MalFGK ₂ -E têm apenas seis hélices por subunidade. O homodímero de ModBC-A está em uma conformação em que as subunidades TM (ModB) se orientam em forma de V invertido com uma cavidade acessível ao citoplasma. As subunidades ABC (ModC), por outro lado, são organizadas em uma conformação aberta e livre de nucleotídeos, na qual a alça P de uma subunidade se enfrenta, mas é separada do motivo LSGGQ da outra. A proteína de ligação ModA está em uma conformação fechada com substrato ligado em uma fenda entre seus dois lóbulos e ligado às alças extracelulares de ModB, em que o substrato está situado diretamente acima da entrada fechada do transportador. A estrutura MalFGK _2- E assemelha-se ao estado de transição catalítica para a hidrólise de ATP. Ele está em uma conformação fechada onde contém duas moléculas de ATP, ensanduichadas entre os motivos Walker A e B de uma subunidade e o motivo LSGGQ da outra subunidade. A proteína de ligação à maltose (MBP ou MalE) está ancorada no lado periplasmático das subunidades TM (MalF e MalG) e uma grande cavidade ocluída pode ser encontrada na interface de MalF e MalG. O arranjo das hélices da MT tem uma conformação fechada em direção ao citoplasma, mas com uma abertura voltada para fora. A estrutura sugere a possibilidade de que MBP pode estimular a atividade ATPase do transportador após a ligação.

Mecanismo de transporte para importadores

Proposta de mecanismo de transporte para importadores ABC. Este modelo de acesso alternado foi baseado nas estruturas cristalinas de ModBC-A e HI1470 / 1.

O mecanismo de transporte para importadores apóia o modelo de acesso alternado. O estado de repouso dos importadores é voltado para dentro, onde a interface do dímero do domínio de ligação de nucleotídeos (NBD) é mantida aberta pelos TMDs e voltada para fora, mas ocluída do citoplasma. Após o acoplamento da proteína de ligação carregada de substrato fechada em direção ao lado periplasmático dos domínios transmembranares, o ATP se liga e o dímero NBD fecha. Isso muda o estado de repouso do transportador para uma conformação voltada para fora, na qual os TMDs foram reorientados para receber substrato da proteína de ligação. Após a hidrólise do ATP, o dímero NBD se abre e o substrato é liberado no citoplasma. A liberação de ADP e P _i reverte o transportador ao seu estado de repouso. A única inconsistência desse mecanismo com o modelo ATP-switch é que a conformação em seu estado de repouso, livre de nucleotídeos, é diferente da conformação voltada para fora esperada. Embora seja esse o caso, o ponto chave é que o NBD não dimeriza a menos que o ATP e a proteína de ligação estejam ligados ao transportador.

Exportadores ABC

Os exportadores de ABC procarióticos são abundantes e têm homólogos próximos em eucariotos. Esta classe de transportadores é estudada com base no tipo de substrato que é transportado. Uma classe está envolvida na exportação de proteínas (por exemplo , toxinas , enzimas hidrolíticas , proteínas da camada S, lantibióticos , bacteriocinas e fatores de competência) e a outra no efluxo de drogas. Os transportadores ABC têm recebido grande atenção porque contribuem para a resistência das células a antibióticos e agentes anticâncer, bombeando drogas para fora das células. Um mecanismo comum é a superexpressão de exportadores ABC como glicoproteína P (P-gp / ABCB1), proteína 1 associada à resistência a múltiplas drogas ( MRP1 / ABCC1 ) e proteína de resistência ao câncer de mama (BCRP / ABCG2) em células cancerosas que limitam a exposição às drogas anticâncer.

Em organismos gram-negativos, os transportadores ABC medeiam a secreção de substratos protéicos através das membranas interna e externa simultaneamente, sem passar pelo periplasma. Esse tipo de secreção é conhecido como secreção do tipo I , que envolve três componentes que funcionam em conjunto: um exportador ABC , uma proteína de fusão de membrana (MFP) e um fator de membrana externa (OMF) . Um exemplo é a secreção de hemolisina (HlyA) de E. coli, onde o transportador ABC de membrana interna HlyB interage com uma proteína de fusão de membrana interna HlyD e um facilitador de membrana externa TolC. TolC permite que a hemolisina seja transportada através das duas membranas, contornando o periplasma.

A resistência bacteriana aos medicamentos tem se tornado um problema de saúde cada vez mais importante. Um dos mecanismos de resistência aos medicamentos está associado ao aumento do efluxo de antibióticos da célula bacteriana. A resistência aos medicamentos associada ao efluxo de medicamentos, mediado pela glicoproteína P , foi originalmente relatada em células de mamíferos. Nas bactérias, Levy e colegas apresentaram a primeira evidência de que a resistência aos antibióticos era causada pelo efluxo ativo de um medicamento. A glicoproteína P é a bomba de efluxo mais bem estudada e, como tal, oferece informações importantes sobre o mecanismo das bombas bacterianas. Embora alguns exportadores transportem um tipo específico de substrato, a maioria dos transportadores expulsa uma classe diversa de drogas com estrutura variável. Esses transportadores são comumente chamados de transportadores ABC multirresistentes a medicamentos (MDR) e às vezes chamados de "aspiradores hidrofóbicos".

Glicoproteína P humana ABCB1 / MDR1

A glicoproteína P (3.A.1.201.1) é uma proteína bem estudada associada à resistência a múltiplos medicamentos. Pertence à família humana ABCB (MDR / TAP) e também é conhecido como ABCB1 ou MDR1 Pgp . MDR1 consiste em um monômero funcional com dois domínios transmembrana (TMD) e dois domínios de ligação de nucleotídeo (NBD). Esta proteína pode transportar substratos principalmente catiônicos ou eletricamente neutros, bem como um amplo espectro de substratos anfifílicos. A estrutura do monômero ABCB1 de tamanho real foi obtida na presença e ausência de nucleotídeo usando crio-cristalografia de elétrons . Sem o nucleotídeo, as DTMs são aproximadamente paralelas e formam um barril envolvendo um poro central, com a abertura voltada para o lado extracelular da membrana e fechada na face intracelular. Na presença do análogo de ATP não hidrolisável, AMP-PNP, os TMDs têm uma reorganização substancial com três domínios claramente segregados. Um poro central, que é fechado entre os TMDs, é ligeiramente aberto em direção à face intracelular com uma lacuna entre dois domínios permitindo o acesso do substrato da fase lipídica. Reembalagem substancial e possível rotação das hélices TM após a ligação de nucleotídeos sugere um modelo de rotação da hélice para o mecanismo de transporte.

Transportadores de plantas

O genoma da planta modelo Arabidopsis thaliana é capaz de codificar 120 proteínas ABC em comparação com 50-70 proteínas ABC que são codificadas pelo genoma humano e moscas da fruta ( Drosophila melanogaster ). As proteínas ABC vegetais são categorizadas em 13 subfamílias com base no tamanho (total, metade ou um quarto), orientação e similaridade geral da sequência de aminoácidos. Homólogos multirresistentes (MDR), também conhecidos como glicoproteínas P, representam a maior subfamília em plantas com 22 membros e a segunda maior subfamília ABC em geral. A subfamília B de transportadores vegetais ABC (ABCBs) é caracterizada por sua localização na membrana plasmática. Os transportadores de plantas ABCB são caracterizados por expressá-los de forma heteróloga em Escherichia coli , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe (levedura de fissão) e células HeLa para determinar a especificidade do substrato. Os transportadores de plantas ABCB têm demonstrado transportar o fitohormônio ácido indol-3-acético (IAA), também conhecido como auxina , o regulador essencial para o crescimento e desenvolvimento das plantas. O transporte polar direcional de auxina medeia as respostas ambientais da planta por meio de processos como fototropismo e gravitropismo. Dois dos transportadores de auxina mais bem estudados, ABCB1 e ABCB19, foram caracterizados como exportadores primários de auxina. Outros transportadores ABCB, como ABCB4, participam na exportação e importação de auxina. Em baixas concentrações de auxina intracelular, o ABCB4 importa auxina até atingir um certo limite, o que em seguida, reverte a função para exportar apenas auxina.

Sav1866

A primeira estrutura de alta resolução relatada para um exportador ABC foi a de Sav1866 (3.A.1.106.2) de Staphylococcus aureus . Sav1866 é um homólogo de transportadores ABC de múltiplas drogas. Mostra semelhança de sequência significativa com transportadores ABC humanos da subfamília B que inclui MDR1 e TAP1 / TAP2. A atividade ATPase de Sav1866 é conhecida por ser estimulada por drogas contra o câncer, como doxorrubicina , vinblastina e outros, o que sugere especificidade de substrato semelhante à glicoproteína P e, portanto, um possível mecanismo comum de translocação de substrato. Sav1866 é um homodímero de meios transportadores e cada subunidade contém um TMD N-terminal com seis hélices e um NBD C-terminal. Os NBDs são semelhantes em estrutura aos de outros transportadores ABC, nos quais os dois locais de ligação de ATP são formados na interface do dímero entre o motivo Walker A de um NBD e o motivo LSGGQ do outro. A estrutura ligada ao ADP de Sav1866 mostra os NBDs em um dímero fechado e as hélices TM divididas em duas "asas" orientadas para o periplasma, formando a conformação voltada para fora. Cada asa consiste em hélices TM1-2 de uma subunidade e TM3-6 da outra subunidade. Ele contém longas alças intracelulares (ICLs ou ICD) conectando os TMDs que se estendem além da bicamada lipídica no citoplasma e interage com o 8 = D. Considerando que os importadores contêm uma hélice de acoplamento curta que contata um único NBD, Sav1866 tem duas hélices de acoplamento intracelular, uma (ICL1) contatando os NBDs de ambas as subunidades e a outra (ICL2) interagindo apenas com a subunidade NBD oposta.

MsbA

MsbA (3.A.1.106.1) é um transportador ABC multirresistente a medicamentos (MDR) e possivelmente uma flippase lipídica . É uma ATPase que transporta o lipídeo A , a porção hidrofóbica do lipopolissacarídeo (LPS), um sacarolipídeo à base de glucosamina que constitui a monocamada externa das membranas externas da maioria das bactérias gram-negativas. O lipídio A é uma endotoxina e, portanto, a perda de MsbA da membrana celular ou mutações que interrompem o transporte resultam no acúmulo de lipídio A na membrana celular interna, resultando em morte celular. É um homólogo bacteriano próximo da glicoproteína P (Pgp) por homologia de sequência de proteína e tem especificidades de substrato sobrepostas com o transportador MDR-ABC LmrA de Lactococcus lactis . O MsbA de E. coli é 36% idêntico à metade do terminal NH ₂ do MDR1 humano, sugerindo um mecanismo comum para o transporte de substratos anfifáticos e hidrofóbicos. O gene MsbA codifica um meio transportador que contém um domínio transmembrana (TMD) fundido com um domínio de ligação de nucleotídeo (NBD). É montado como um homodímero com massa molecular total de 129,2 kD. MsbA contém 6 TMDs no lado periplasmático, um NBD localizado no lado citoplasmático da membrana celular e um domínio intracelular (ICD), fazendo a ponte entre o TMD e o NBD. Esta hélice conservada que se estende dos segmentos TMD para dentro ou perto do sítio ativo do NBD é amplamente responsável pela diafonia entre o TMD e o NBD. Em particular, ICD1 serve como um pivô conservado em torno do qual o NBD pode girar, permitindo, portanto, que o NBD se desassocie e dimerize durante a ligação de ATP e hidrólise.

Estruturas de MsbA representando os três estados conformacionais: apo aberta ( PDB : 3b5w ), apo fechada ( PDB : 3b5x ) e ligada a nucleotídeos ( PDB : 3b60 )

As estruturas de raios-X publicadas anteriormente (e agora retraídas) de MsbA eram inconsistentes com o homólogo bacteriano Sav1866. As estruturas foram reexaminadas e constatou-se um erro na atribuição da mão resultante de modelos incorretos de MsbA. Recentemente, os erros foram corrigidos e novas estruturas foram relatadas. O estado de repouso de E. coli MsbA exibe uma forma de "V" invertido com uma câmara acessível ao interior do transportador, sugerindo uma conformação aberta voltada para dentro . Os contatos do dímero estão concentrados entre os loops extracelulares e enquanto os NBDs estão separados por ≈50Å, as subunidades estão voltadas uma para a outra. A distância entre os resíduos no local da interface do dímero foi verificada por experimentos de reticulação e estudos de espectroscopia EPR . A câmara relativamente grande permite acomodar grandes grupos de cabeças, como os presentes no lipídeo A. Mudanças conformacionais significativas são necessárias para mover os grandes grupos de cabeças de açúcar através da membrana. A diferença entre as duas estruturas livres de nucleotídeos (apo) é o pivô de ≈30 ° das hélices de TM4 / TM5 em relação às hélices de TM3 / TM6. No estado de apo fechado (de V. cholerae MsbA), os NBDs estão alinhados e, embora mais próximos, não formaram um sanduíche de ATP, e os loops P dos monômeros opostos estão posicionados um ao lado do outro. Em comparação com a conformação aberta, a interface do dímero dos TMDs na conformação fechada voltada para dentro tem contatos extensos. Para ambas as conformações apo de MsbA, a abertura da câmara está voltada para dentro. A estrutura de MsbA-AMP-PNP (5'-adenilil-β-γ-imidodifosfato), obtido a partir de S. typhimurium , é semelhante a Sav1866. Os NBDs nesta conformação voltada para fora, ligada ao nucleotídeo , se reúnem para formar um sanduíche de dímero ATP canônico, ou seja, o nucleotídeo está situado entre o P-loop e o motivo LSGGQ. A transição conformacional de MsbA-fechado-apo para MsbA-AMP-PNP envolve duas etapas, que são mais provavelmente combinadas: um pivô de ≈10 ° de hélices TM4 / TM5 em direção a TM3 / TM6, trazendo os NBDs mais próximos, mas não em alinhamento seguido por inclinação das hélices TM4 / TM5 ≈20 ° fora do plano. O movimento de torção resulta na separação das hélices do TM3 / TM6 do TM1 / TM2, levando a uma mudança de uma conformação voltada para dentro para uma voltada para fora. Assim, as mudanças tanto na orientação quanto no espaçamento dos NBDs reorganizam dramaticamente o empacotamento das hélices transmembrana e trocam efetivamente o acesso à câmara do folheto interno para o externo da membrana. As estruturas determinadas para MsbA são a base para o modelo basculante de transporte. As estruturas descritas também destacam a natureza dinâmica dos exportadores ABC, como também sugerido por estudos de fluorescência e EPR. Um trabalho recente resultou na descoberta de inibidores de MsbA.

Mecanismo de transporte para exportadores

Proposta de mecanismo de transporte para exportadores ABC. Este modelo foi baseado em estudos estruturais e bioquímicos em MsbA.

Os exportadores ABC têm um mecanismo de transporte que é consistente com o modelo de acesso alternado e o modelo de switch ATP. Nos estados apo dos exportadores, a conformação é voltada para dentro e os TMDs e NBDs estão relativamente distantes um do outro para acomodar substratos anfifílicos ou hidrofóbicos. Para MsbA, em particular, o tamanho da câmara é grande o suficiente para acomodar os grupos de açúcar dos lipopolissacarídeos (LPS). Como foi sugerido por vários grupos, a ligação do substrato inicia o ciclo de transporte. O "golpe de força", ou seja, a ligação do ATP que induz a dimerização do NBD e a formação do sanduíche de ATP, impulsiona as mudanças conformacionais nos TMDs. No MsbA, os grupos de cabeças de açúcar são sequestrados dentro da câmara durante o "golpe de força". A cavidade é forrada com resíduos carregados e polares que são provavelmente solvatados, criando um ambiente energeticamente desfavorável para substratos hidrofóbicos e energeticamente favorável para frações polares em compostos anfifílicos ou grupos de açúcar de LPS. Uma vez que o lipídio não pode ser estável por muito tempo no ambiente da câmara, o lipídio A e outras moléculas hidrofóbicas podem "virar" para uma posição energeticamente mais favorável dentro do folheto da membrana externa. A "inversão" também pode ser conduzida pelo cisalhamento do corpo rígido dos TMDs enquanto as caudas hidrofóbicas do LPS são arrastadas através da bicamada lipídica. O reembalamento das hélices muda a conformação para um estado voltado para fora. A hidrólise do ATP pode alargar a abertura periplasmática e empurrar o substrato em direção ao folheto externo da bicamada lipídica. A hidrólise da segunda molécula de ATP e a liberação de P _i separam os NBDs, seguida pela restauração do estado de repouso, abrindo a câmara em direção ao citoplasma para outro ciclo.

Papel na multirresistência a medicamentos

Os transportadores ABC são conhecidos por desempenhar um papel crucial no desenvolvimento da resistência a múltiplas drogas (MDR). No MDR, os pacientes que estão tomando medicamentos acabam desenvolvendo resistência não apenas ao medicamento que estão tomando, mas também a vários tipos diferentes de medicamentos. Isso é causado por vários fatores, um dos quais é o aumento da expulsão da droga da célula pelos transportadores ABC. Por exemplo, a proteína ABCB1 ( glicoproteína P ) atua no bombeamento de drogas supressoras de tumor para fora da célula. Pgp também chamado de MDR1, ABCB1, é o protótipo dos transportadores ABC e também o gene mais extensamente estudado. Pgp é conhecido por transportar compostos orgânicos catiônicos ou neutros. Alguns membros da família ABCC, também conhecidos como MRP, também demonstraram conferir MDR a compostos de ânions orgânicos. O membro mais estudado na família ABCG é ABCG2, também conhecido como BCRP (proteína de resistência ao câncer de mama) confere resistência à maioria dos inibidores da Topoisomerase I ou II, como topotecano, irinotecano e doxorrubicina.

Não está claro exatamente como essas proteínas podem translocar uma grande variedade de drogas, mas um modelo (o modelo do aspirador de pó hidrofóbico) afirma que, na glicoproteína P, as drogas são ligadas indiscriminadamente da fase lipídica com base em sua hidrofobicidade.

A descoberta da primeira proteína transportadora ABC eucariótica veio de estudos em células tumorais e células em cultura que exibiram resistência a vários medicamentos com estruturas químicas não relacionadas. Estas células demonstraram expressar níveis elevados de proteína de transporte de resistência a múltiplas drogas (MDR), que foi originalmente chamada de glicoproteína P (P-gp), mas também é referida como proteína 1 de resistência a múltiplas drogas (MDR1) ou ABCB1. Essa proteína usa a hidrólise de ATP , assim como os outros transportadores ABC, para exportar uma grande variedade de drogas do citosol para o meio extracelular. Em células multirresistentes, o gene MDR1 é frequentemente amplificado. Isso resulta em uma grande superprodução da proteína MDR1. Os substratos de ABCB1 de mamífero são principalmente moléculas solúveis em lipídios planas com uma ou mais cargas positivas. Todos esses substratos competem entre si para o transporte, sugerindo que eles se ligam aos mesmos locais ou sobrepostos na proteína. Muitos dos medicamentos transportados pelo ABCB1 são pequenos medicamentos não polares que se difundem através do meio extracelular para o citosol, onde bloqueiam várias funções celulares. Drogas como colchicina e vimblastina , que bloqueiam a montagem dos microtúbulos, atravessam livremente a membrana para o citosol, mas a exportação dessas drogas pelo ABCB1 reduz sua concentração na célula. Portanto, é necessária uma concentração maior das drogas para matar as células que expressam ABCB1 do que aquelas que não expressam o gene.

Outros transportadores ABC que contribuem para a resistência a múltiplas drogas são ABCC1 (MRP1) e ABCG2 (proteína de resistência ao câncer de mama).

Para resolver os problemas associados à multirresistência pelo MDR1, diferentes tipos de medicamentos podem ser usados ​​ou os próprios transportadores ABC devem ser inibidos. Para que outros tipos de medicamentos funcionem, eles devem contornar o mecanismo de resistência, que é o transportador ABC . Para fazer isso, outras drogas anticâncer podem ser utilizadas, como drogas alquilantes ( ciclofosfamida ), antimetabólitos ( 5-fluorouracil ) e drogas modificadas com antraciclina ( anamicina e peptídeo- doxorrubicina ). Esses medicamentos não funcionariam como substrato dos transportadores ABC e, portanto, não seriam transportados. A outra opção é usar uma combinação de drogas inibidoras de ABC e drogas anticâncer ao mesmo tempo. Isso reverteria a resistência aos medicamentos anticâncer para que funcionassem como pretendido. Os substratos que revertem a resistência aos medicamentos anticâncer são chamados de quimiossensibilizadores.

Reversão da multirresistência a medicamentos

A resistência aos medicamentos é um problema clínico comum que ocorre em pacientes que sofrem de doenças infecciosas e em pacientes que sofrem de câncer. Microrganismos procarióticos e eucarióticos , bem como células neoplásicas, são freqüentemente encontrados para serem resistentes a drogas. O MDR é freqüentemente associado à superexpressão de transportadores ABC. A inibição dos transportadores ABC por compostos de baixo peso molecular foi extensivamente investigada em pacientes com câncer; no entanto, os resultados clínicos foram decepcionantes. Recentemente, várias estratégias de RNAi foram aplicadas para reverter MDR em diferentes modelos de tumor e esta tecnologia é eficaz na reversão de MDR mediada por transportador ABC em células cancerosas e é, portanto, uma estratégia promissora para superar MDR por aplicações terapêuticas de genes. A tecnologia de RNAi também pode ser considerada para superar a MDR em doenças infecciosas causadas por patógenos microbianos.

Papel fisiológico

Além de conferir MDR nas células tumorais, os transportadores ABC também são expressos nas membranas das células saudáveis, onde facilitam o transporte de várias substâncias endógenas, bem como de substâncias estranhas ao organismo. Por exemplo, transportadores ABC como Pgp, MRPs e BCRP limitam a absorção de muitos medicamentos do intestino e bombeiam medicamentos das células do fígado para a bile como um meio de remover substâncias estranhas do corpo. Um grande número de drogas é transportado pelos próprios transportadores ABC ou afeta o transporte de outras drogas. O último cenário pode levar a interações medicamentosas , às vezes resultando em efeitos alterados das drogas.

Métodos para caracterizar as interações do transportador ABC

Existem vários tipos de ensaio que permitem a detecção de interações do transportador ABC com compostos endógenos e xenobióticos. A complexidade do ensaio varia de ensaios de membrana relativamente simples. como ensaio de transporte vesicular, ensaio de ATPase para ensaios baseados em células mais complexas até intrincados in vivo Jeffrey P, Summerfield SG (2007). "Desafios para a triagem da barreira hematoencefálica (BBB)". Xenobiotica . 37 (10-11): 1135-1151. doi : 10.1080 / 00498250701570285 . PMID  17968740 . S2CID  25944548 . metodologias de detecção.

Ensaios de membrana

O ensaio de transporte vesicular detecta a translocação de moléculas por transportadores ABC. As membranas preparadas sob condições adequadas contêm vesículas orientadas de dentro para fora com o local de ligação do ATP e o local de ligação do substrato do transportador voltado para o tampão externo. Os substratos do transportador são absorvidos pelas vesículas de uma maneira dependente de ATP. A filtração rápida usando filtros de fibra de vidro ou membranas de nitrocelulose é usada para separar as vesículas da solução de incubação e o composto de teste preso dentro das vesículas é retido no filtro. A quantidade de moléculas não marcadas transportadas é determinada por HPLC, LC / MS, LC / MS / MS. Alternativamente, os compostos são radiomarcados, fluorescentes ou têm uma etiqueta fluorescente de modo que a radioatividade ou fluorescência retida no filtro possa ser quantificada.

Vários tipos de membranas de diferentes fontes (por exemplo, células de insetos, linhas de células de mamíferos transfectadas ou selecionadas) são usados ​​em estudos de transporte vesicular. As membranas estão disponíveis comercialmente ou podem ser preparadas a partir de várias células ou mesmo tecidos, por exemplo, membranas canaliculares do fígado. Este tipo de ensaio tem a vantagem de medir a disposição real do substrato através da membrana celular. Sua desvantagem é que os compostos com permeabilidade passiva de média a alta não são retidos dentro das vesículas, tornando as medições de transporte direto com esta classe de compostos difíceis de realizar.

O ensaio de transporte vesicular pode ser realizado em um ambiente "indireto", onde drogas de teste interagindo modulam a taxa de transporte de um composto repórter. Este tipo de ensaio é particularmente adequado para a detecção de possíveis interações fármaco-fármaco e interações fármaco-substrato endógeno. Não é sensível à permeabilidade passiva dos compostos e, portanto, detecta todos os compostos em interação. No entanto, não fornece informações sobre se o composto testado é um inibidor do transportador ou um substrato do transportador que inibe sua função de forma competitiva. Um exemplo típico de um ensaio de transporte vesicular indireto é a detecção da inibição do transporte de taurocolato por ABCB11 ( BSEP ).

Ensaios baseados em células inteiras

As células que expressam o transportador de efluxo bombeiam ativamente substratos para fora da célula, o que resulta em uma menor taxa de acúmulo de substrato, menor concentração intracelular em estado estacionário ou uma taxa mais rápida de eliminação de substrato de células carregadas com o substrato. Substratos radioativos transportados ou corantes fluorescentes marcados podem ser medidos diretamente, ou em uma configuração indireta, a modulação da acumulação de um substrato de sonda (por exemplo, corantes fluorescentes como rodamina 123 ou calceína) pode ser determinada na presença de uma droga de teste.

Calceína-AM, um derivado altamente permeável da calceína penetra prontamente nas células intactas, onde as esterases endógenas hidrolisam rapidamente em calceína fluorescente. Em contraste com a calceína-AM, a calceína tem baixa permeabilidade e, portanto, fica presa na célula e se acumula. Como a calceína-AM é um excelente substrato dos transportadores de efluxo MDR1 e MRP1, as células que expressam os transportadores MDR1 e / ou MRP1 bombeiam a calceína-AM para fora da célula antes que as esterases possam hidrolisá-la. Isso resulta em uma menor taxa de acúmulo celular de calceína. Quanto mais alta a atividade MDR na membrana celular, menos calceína é acumulada no citoplasma. Em células que expressam MDR, a adição de um inibidor de MDR ou um substrato de MDR em excesso aumenta dramaticamente a taxa de acúmulo de calceína. A atividade do transportador de múltiplas drogas é refletida pela diferença entre as quantidades de corante acumuladas na presença e na ausência do inibidor. Usando inibidores seletivos, a atividade de transporte de MDR1 e MRP1 pode ser facilmente distinguida. Este ensaio pode ser usado para rastrear drogas para interações de transportador e também para quantificar a atividade MDR das células. O ensaio de calceína é o ensaio proprietário da SOLVO Biotechnology.

Subfamílias

Subfamílias de mamíferos

Existem 49 transportadores ABC conhecidos presentes em humanos, que são classificados em sete famílias pela Organização do Genoma Humano.

Uma lista completa de transportadores ABC humanos pode ser encontrada em.

ABCA

A subfamília ABCA é composta por 12 transportadores completos divididos em dois subgrupos. O primeiro subgrupo consiste em sete genes que são mapeados para seis cromossomos diferentes . São ABCA1 , ABCA2 , ABCA3 e ABCA4 , ABCA7 , ABCA12 e ABCA13 . O outro subgrupo consiste em ABCA5 e ABCA6 e ABCA8 , ABCA9 e ABCA10 . A8-10. Todo o subgrupo 2 está organizado em um grupo de cromossomos cabeça a cauda no cromossomo 17q 24. Os genes neste segundo subgrupo são diferenciados dos genes semelhantes a ABCA1 por terem 37-38 exons em oposição aos 50 exons em ABCA1. O subgrupo ABCA1 está implicado no desenvolvimento de doenças genéticas. Na doença recessiva de Tânger, a proteína ABCA1 sofre mutação. Além disso, o ABCA4 mapeia para uma região do cromossomo 1p21 que contém o gene da doença de Stargardt. Este gene é altamente expresso em fotorreceptores de bastonetes e sofre mutação na doença de Stargardt, retinite recessiva, pigmentismo e na maioria dos casos de distrofia recessiva de bastonetes.

ABCB

A subfamília ABCB é composta por quatro transportadores completos e duas meias transportadoras. Esta é a única subfamília humana a ter tipos de transportadores meio e completos. ABCB1 foi descoberto como uma proteína superexpressa em certas células tumorais resistentes a drogas. É expresso principalmente na barreira hematoencefálica e no fígado e acredita-se que esteja envolvido na proteção das células contra toxinas. As células que superexpressam essa proteína apresentam resistência a múltiplos medicamentos .

ABCC

A subfamília ABCC contém treze membros e nove desses transportadores são chamados de Proteínas de Resistência a Múltiplos Fármacos (MRPs). As proteínas MRP são encontradas em toda a natureza e medeiam muitas funções importantes. Eles são conhecidos por estarem envolvidos no transporte de íons, secreção de toxinas e transdução de sinal. Das nove proteínas MRP, quatro delas, MRP4, 5, 8, 9, (ABCC4, 5, 11 e 12), têm uma estrutura ABC típica com quatro domínios, compreendendo dois domínios abrangendo a membrana, com cada domínio abrangendo seguido por um domínio de ligação de nucleotídeo. Eles são chamados de MRPs curtos. Os 5 MRPs restantes (MRP1, 2, 6, 7 (ABCC1, 2, 3, 6 e 10) são conhecidos como MRPs longos e apresentam um quinto domínio adicional em seu terminal N.

O CFTR , o transportador envolvido na doença fibrose cística , também é considerado parte dessa subfamília. A fibrose cística ocorre após mutação e perda da função do CFTR.

Os receptores de sulfonilureia (SUR) , envolvidos na secreção de insulina, função neuronal e função muscular, também fazem parte dessa família de proteínas. Mutações nas proteínas SUR são uma causa potencial de diabetes mellitus neonatal . SUR também é o local de ligação para drogas como sulfonilureias e ativadores de abertura dos canais de potássio, como o diazóxido .

ABCD

A subfamília ABCD consiste em quatro genes que codificam meios transportadores expressos exclusivamente no peroxissomo . ABCD1 é responsável pela forma ligada ao X de adrenoleucodistrofia (ALD), que é uma doença caracterizada por neurodegeneração e deficiência adrenal que normalmente é iniciada no final da infância. As células de pacientes com ALD apresentam acúmulo de ácidos graxos saturados não ramificados, mas o papel exato do ABCD1 no processo ainda é indeterminado. Além disso, a função de outros genes ABCD ainda não foi determinada, mas acredita-se que exerçam funções relacionadas no metabolismo dos ácidos graxos .

ABCE e ABCF

Ambos os subgrupos são compostos de genes que possuem domínios de ligação de ATP intimamente relacionados a outros transportadores ABC, mas esses genes não codificam para domínios transmembranares. ABCE consiste em apenas um membro, OABP ou ABCE1 , que é conhecido por reconhecer certos oligodendrócitos produzidos em resposta a certas infecções virais. Cada membro do subgrupo ABCF consiste em um par de domínios de ligação de ATP.

ABCG

Seis meios transportadores com locais de ligação de ATP no terminal N e domínios transmembranares no terminal C constituem a subfamília ABCG. Essa orientação é oposta a todos os outros genes ABC. Existem apenas 5 genes ABCG no genoma humano, mas existem 15 no genoma da Drosophila e 10 na levedura. O gene ABCG2 foi descoberto em linhagens celulares selecionadas para resistência de alto nível para mitoxantrona e nenhuma expressão de ABCB1 ou ABCC1 . ABCG2 pode exportar drogas anticâncer de antrociclina, bem como topotecano , mitoxantrona ou doxorrubicina como substratos. Verificou-se que as translocações cromossômicas causam a amplificação ou rearranjo ABCG2 encontrado em linhas de células resistentes. A função normal de ABCG2 não é conhecida.

Subfamílias de espécies cruzadas

O seguinte sistema de classificação para transportadores de soluto transmembrana foi construído no TCDB.

Três famílias de exportadores ABC são definidas por suas origens evolutivas. Os exportadores ABC1 evoluíram por triplicação intragênica de um precursor 2 TMS (TMS = segmento transmembrana. Uma proteína "2 TMS" tem 2 segmentos transmembrana) para dar 6 proteínas TMS. Os exportadores ABC2 evoluíram por duplicação intragênica de um precursor 3 TMS e os exportadores ABC3 evoluíram de um precursor 4 TMS que se duplicou extragenicamente para dar duas proteínas 4 TMS, ambas necessárias para a função de transporte, ou intragenicamente para dar 8 ou 10 proteínas TMS. As 10 proteínas TMS parecem ter dois TMSs extras entre as duas unidades de repetição de 4 TMS. A maioria dos sistemas de captação (todos exceto 3.A.1.21) são do tipo ABC2, divididos em tipo I e tipo II pela maneira como lidam com os nucleotídeos. Uma subfamília especial de importadores ABC2 chamada ECF usa uma subunidade separada para reconhecimento de substrato.

ABC1 ( InterPro :  IPR036640 ):

ABC2 ( InterPro :  IPR000412 [parcial]):

ABC3 ( InterPro :  IPR003838 ):

Veja as proteínas pertencentes à Superfamília ABC: aqui

Imagens

Muitas estruturas de domínios solúveis em água de proteínas ABC foram produzidas nos últimos anos.

Veja também

• Domínio de ligação de ATP de transportadores ABC
• Domínio transmembrana de transportadores ABC
• Elizabeth P. Carpenter , bióloga estrutural britânica, é a primeira a descrever a estrutura do transportador ABC humano de ABC10

Referências

Leitura adicional

links externos

• Classificação dos transportadores ABC em TCDB
• Banco de dados ABCdb Archaeal and Bacterial ABC Systems, ABCdb
• ATP-Binding + cassette + transportadores no US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)