BEAMing - BEAMing
BEAMing , que significa grânulos, emulsão, amplificação, magnetismo, é um método de PCR digital altamente sensível que combina PCR de emulsão e citometria de fluxo para identificar e quantificar mutações somáticas específicas presentes no DNA.
Processo
O BEAMing começa com o isolamento do DNA da amostra de sangue ou plasma de um paciente. As regiões alvo do DNA purificado passam por uma etapa de pré-amplificação com PCR convencional utilizando iniciadores de sequências conhecidas para amplificar as regiões genéticas de interesse.
Os modelos de DNA amplificados são então introduzidos em primers que são covalentemente ligados a esferas magnéticas por meio de interações estreptavidina - biotina e são compartimentalizados em microgotículas aquosas de uma emulsão de água em óleo . A fase aquosa é emulsificada com o óleo, criando milhões de gotículas de água individuais com um diâmetro de 3-10 mícrons. Dentro de cada gota, uma reação de PCR separada é realizada. Devido ao tamanho pequeno, cada gota d'água contém em média uma única molécula de DNA e uma partícula magnética. Além do DNA pré-amplificado, cada gota de emulsão contém os reagentes necessários e esferas magnéticas revestidas com primer direcionado para a sequência para realizar a reação de PCR de emulsão. As gotículas de microemulsão são submetidas a ciclos de temperatura usando métodos convencionais de PCR. Cada molde de DNA (com a esfera magnética presente no compartimento aquoso) é estendido e amplificado, resultando em uma esfera revestida com milhares de cópias idênticas do fragmento de DNA molde.
Normalmente, uma DNA polimerase de alta fidelidade é usada para limitar os erros normalmente introduzidos durante a PCR. Essa precaução limita o risco de detecção de falso-positivo e permite a discriminação precisa das moléculas-alvo.
Após a etapa de PCR em emulsão, a fase aquosa e a fase oleosa são separadas para que as micropartículas possam ser coletadas na fase aquosa. As gotículas de microemulsão são então quebradas para liberar as esferas magnéticas, que possuem as cópias amplificadas do DNA anexadas. As contas são purificadas magneticamente e sondas fluorescentes específicas de pares de bases são anexadas. Isso ajuda a distinguir entre fragmentos de DNA do tipo selvagem e mutante, pois uma sonda fluorescente se liga especificamente ao DNA do tipo selvagem e a outra ao DNA mutante específico. Cada esfera marcada com fluorescência é analisada em um citômetro de fluxo, resultando na separação do DNA mutante do tipo selvagem, bem como na proporção de DNA mutante para o tipo selvagem presente em uma amostra.
As gotículas de emulsão microscópica usadas em BEAMing permitem a compartimentação de segmentos de DNA em gotículas únicas. O PCR de emulsão é executado no DNA compartimentado, permitindo que centenas de milhões de reações de PCR ocorram em paralelo. Esta plataforma de PCR massivamente paralela oferece altos níveis de sensibilidade (0,001%) para a detecção de moléculas raras de DNA de tumor entre um grande fundo de DNA de tipo selvagem.
Formulários
O BEAMing é frequentemente usado na pesquisa do câncer para realizar avaliações de DNA tumoral circulante ( ctDNA ), também conhecido como biópsia líquida . Também permite a quantificação da fração mutante de uma amostra, que pode ser rastreada ao longo do tempo usando medições de plasma em série. O método tem um limite de sensibilidade de 0,01%.
História
No final da década de 1990, Vogelstein e Kinzler cunharam o termo “ reação em cadeia da polimerase digital ” ao conduzir pesquisas sobre mutações somáticas associadas e potencialmente causadoras do câncer colorretal . Um desafio fundamental para o qual a PCR digital foi projetada foi a detecção de pequenas quantidades de uma mutação somática pré-determinada em grandes populações de células. Embora tanto o PCR digital quanto o clássico possam ser usados em análises quantitativas ou qualitativas, o PCR digital analisa amostras de uma molécula de cada vez para produzir um sinal tudo ou nada, aumentando assim a razão sinal-ruído e a sensibilidade geral a alvos raros. Os resultados desses estudos indicaram que a PCR digital foi capaz de quantificar de forma confiável a proporção relativa de sequências variantes em uma amostra de DNA.
O BEAMing cresceu a partir da tecnologia de PCR digital e, em 2003, foi descrito em uma publicação da Nature Methods da equipe de Vogelstein. Em 2005, a equipe de Vogelstein publicou seus primeiros dados clínicos aplicando a tecnologia BEAMing para analisar amostras de plasma de pacientes com câncer. Em uma publicação da Nature Medicine de 2008 , as medições de ctDNA do BEAMing foram sensíveis o suficiente para monitorar de forma confiável a dinâmica do tumor.
Em 2008, a Inostics GmbH foi formada para comercializar o BEAMing. Em 2014, a Inostics foi adquirida pela Sysmex Corporation para formar a Sysmex Inostics.