Bio-MEMS - Bio-MEMS
Bio-MEMS é uma abreviatura de sistemas microeletromecânicos biomédicos (ou biológicos) . Bio-MEMS tem uma sobreposição considerável e às vezes é considerado sinônimo de lab-on-a-chip (LOC) e sistemas de análise micro total (μTAS) . Bio-MEMS é tipicamente mais focado em peças mecânicas e tecnologias de microfabricação adequadas para aplicações biológicas. Por outro lado, lab-on-a-chip está preocupado com a miniaturização e integração de processos de laboratório e experimentos em chips únicos (geralmente microfluídicos ). Nesta definição, os dispositivos lab-on-a-chip não têm estritamente aplicações biológicas, embora a maioria tenha ou possa ser adaptada para fins biológicos. Da mesma forma, os sistemas de análise micro total podem não ter aplicações biológicas em mente e geralmente são dedicados à análise química . Uma definição ampla para bio-MEMS pode ser usada para se referir à ciência e tecnologia de operação em microescala para aplicações biológicas e biomédicas, que podem ou não incluir quaisquer funções eletrônicas ou mecânicas. A natureza interdisciplinar do bio-MEMS combina ciências de materiais , ciências clínicas , medicina , cirurgia , engenharia elétrica , engenharia mecânica , engenharia óptica , engenharia química e engenharia biomédica . Algumas das suas principais aplicações incluem genómica , proteómica , diagnóstico molecular , de diagnósticos de ponto-de-cuidado , engenharia de tecidos , análise de célula única e microdispositivos implantáveis.
História
Em 1967, SB Carter relatou o uso de ilhas de paládio evaporadas pela sombra para fixação de células . Após este primeiro estudo bio-MEMS, o desenvolvimento subsequente no campo foi lento por cerca de 20 anos. Em 1985, a Unipath Inc. comercializou ClearBlue , um teste de gravidez usado ainda hoje que pode ser considerado o primeiro dispositivo microfluídico contendo papel e o primeiro produto microfluídico a ser comercializado. Em 1990, Andreas Manz e H. Michael Widmer da Ciba-Geigy (agora Novartis ), Suíça, cunharam pela primeira vez o termo sistema de análise micro total (μTAS) em seu artigo original, propondo o uso de sistemas de análise química total miniaturizados para detecção química. Houve três fatores de motivação principais por trás do conceito de μTAS. Em primeiro lugar, a descoberta de drogas nas últimas décadas que antecederam a década de 1990 foi limitada devido ao tempo e custo de execução de muitas análises cromatográficas em paralelo em equipamentos macroscópicos . Em segundo lugar, o Projeto Genoma Humano (HGP) , iniciado em outubro de 1990, criou uma demanda por melhorias na capacidade de sequenciamento de DNA . A eletroforese capilar tornou-se assim um foco para a separação química e de DNA. Em terceiro lugar, o DARPA do Departamento de Defesa dos Estados Unidos apoiou uma série de programas de pesquisa microfluídica na década de 1990, após perceber que havia a necessidade de desenvolver microssistemas implantáveis em campo para a detecção de agentes químicos e biológicos que eram potenciais ameaças militares e terroristas . Os pesquisadores começaram a usar equipamentos de fotolitografia para microfabricação de sistemas microeletromecânicos (MEMS) herdados da indústria de microeletrônica . Na época, a aplicação de MEMS à biologia era limitada porque essa tecnologia era otimizada para silício ou wafers de vidro e usava fotorresistentes à base de solvente que não eram compatíveis com material biológico. Em 1993, George M. Whitesides , um químico de Harvard , introduziu a microfabricação barata baseada em PDMS e isso revolucionou o campo dos bio-MEMS. Desde então, o campo de bio-MEMS explodiu. As principais realizações técnicas selecionadas durante o desenvolvimento de bio-MEMS da década de 1990 incluem:
- Em 1991, o primeiro chip de oligonucleotídeo foi desenvolvido
- Em 1998, as primeiras microagulhas sólidas foram desenvolvidas para a administração de drogas
- Em 1998, o primeiro chip de reação em cadeia da polimerase de fluxo contínuo foi desenvolvido
- Em 1999, a primeira demonstração de fluxos laminares heterogêneos para tratamento seletivo de células em microcanais.
Hoje, hidrogéis como agarose , fotoresistentes biocompatíveis e automontagem são áreas-chave de pesquisa no aprimoramento de bio-MEMS como substitutos ou complementos para PDMS .
Abordagens
Materiais
Silício e vidro
Técnicas micromecânicas convencionais, tais como ataque químico molhado , erosão seca profundo por iões reactivos gravura, pulverização catódica , ligação anódica , e a ligação por fusão têm sido utilizadas na bio-MEMS para fazer canais de fluxo , fluxo de sensores , detectores químicos, capilares de separação, misturadores, filtros , bombas e válvulas. No entanto, existem algumas desvantagens no uso de dispositivos baseados em silício em aplicações biomédicas, como seu alto custo e bioincompatibilidade . Devido ao fato de ser de uso único, maior do que seus homólogos MEMS e a necessidade de instalações de sala limpa , os altos custos de material e processamento tornam os bio-MEMS baseados em silício menos economicamente atraentes. '' In vivo '', os bio-MEMS baseados em silício podem ser prontamente funcionalizados para minimizar a adsorção de proteínas , mas a fragilidade do silício continua sendo um grande problema.
Plásticos e polímeros
O uso de plásticos e polímeros em bio-MEMS é atraente porque podem ser facilmente fabricados, compatíveis com microusinagem e métodos de prototipagem rápida , além de apresentarem baixo custo. Muitos polímeros também são opticamente transparentes e podem ser integrados em sistemas que usam técnicas de detecção óptica, como fluorescência , absorção de UV / Vis ou método Raman . Além disso, muitos polímeros são biologicamente compatíveis , quimicamente inertes a solventes e eletricamente isolantes para aplicações onde campos elétricos fortes são necessários, como separação eletroforética . A química da superfície de polímeros também pode ser modificada para aplicações específicas. Especificamente, a superfície dos PDMSs pode ser irradiada com íons com elementos como magnésio , tântalo e ferro para diminuir a hidrofobicidade da superfície , permitindo uma melhor adesão celular em aplicações '' in vivo ''. Os polímeros mais comuns usados em bio-MEMS incluem PMMA , PDMS , OSTEmer e SU-8 .
Materiais biológicos
B) & C) Fibroblastos individuais são espacialmente restritos à geometria do micropadrão de fibronectina.
A manipulação e padronização em microescala de materiais biológicos, como proteínas , células e tecidos, têm sido usados no desenvolvimento de matrizes baseadas em células , microarranjos , engenharia de tecidos baseada em microfabricação e órgãos artificiais . Micropadrões biológicos podem ser usados para análise de célula única de alto rendimento , controle preciso do microambiente celular, bem como integração controlada de células em arquiteturas multicelulares apropriadas para recapitular as condições in vivo . Fotolitografia , impressão por microcontato , entrega microfluídica seletiva e monocamadas automontadas são alguns métodos usados para padronizar moléculas biológicas em superfícies. A micropadronização celular pode ser feita usando a padronização de microcontato de proteínas da matriz extracelular , eletroforese celular , arranjos de pinças ópticas , dieletroforese e superfícies eletroquimicamente ativas.
Papel
A microfluídica de papel (às vezes chamada de lab on paper) é o uso de substratos de papel na microfabricação para manipular o fluxo de fluido para diferentes aplicações. A microfluídica de papel tem sido aplicada em eletroforese de papel e imunoensaios , sendo o mais notável o teste de gravidez comercializado, ClearBlue. As vantagens de usar papel para microfluídica e eletroforese em bio-MEMS incluem seu baixo custo, biodegradabilidade e ação de absorção natural . Uma grande desvantagem da microfluídica baseada em papel é a dependência da taxa de absorção das condições ambientais, como temperatura e umidade relativa. Dispositivos analíticos baseados em papel são particularmente atraentes para diagnósticos de ponto de atendimento em países em desenvolvimento, tanto pelo baixo custo do material quanto pela ênfase em testes colorimétricos que permitem aos profissionais médicos interpretar facilmente os resultados a olho nu. Em comparação com os canais microfluídicos tradicionais, os microcanais de papel são acessíveis para a introdução de amostras (especialmente amostras de estilo forense , como fluidos corporais e solo), bem como suas propriedades de filtragem naturais que excluem resíduos celulares, sujeira e outras impurezas nas amostras. As réplicas em papel demonstraram a mesma eficácia na execução de operações microfluídicas comuns , como focalização hidrodinâmica , extração molecular baseada em tamanho, micro-mistura e diluição; as microplacas comuns de 96 e 384 poços para manipulação e análise automatizada de líquidos foram reproduzidas por fotolitografia em papel para obter um perfil mais fino e menor custo de material, mantendo a compatibilidade com leitores de microplaca convencionais . As técnicas de micropadronização de papel incluem fotolitografia , corte a laser , impressão a jato de tinta, tratamento de plasma e padronização de cera.
Eletrocinética
A eletrocinética tem sido explorada em bio-MEMS para separar misturas de moléculas e células usando campos elétricos. Na eletroforese , uma espécie carregada em um líquido se move sob a influência de um campo elétrico aplicado . A eletroforese tem sido usada para fracionar íons pequenos , moléculas orgânicas carregadas, proteínas e DNA . Eletroforese e microfluídica são altamente sinérgicos porque é possível usar tensões mais altas em microcanais devido à remoção de calor mais rápida . A focalização isoelétrica é a separação de proteínas, organelas e células com diferentes pontos isoelétricos . A focalização isoelétrica requer um gradiente de pH (geralmente gerado com eletrodos ) perpendicular à direção do fluxo. A classificação e o foco das espécies de interesse são alcançados porque uma força eletroforética causa migração perpendicular até fluir ao longo de seus respectivos pontos isoelétricos. A dieletroforese é o movimento de partículas não carregadas devido à polarização induzida de campos elétricos não uniformes. A dieletroforese pode ser usada em bio-MEMS para armadilhas de dieletroforese, concentrando partículas específicas em pontos específicos nas superfícies e desviando as partículas de um fluxo para outro para concentração dinâmica.
Microfluídica
Microfluídica refere-se a sistemas que manipulam pequenas (µL, nL, pL, fL) quantidades de fluidos em substratos microfabricados. As abordagens microfluídicas para bio-MEMS conferem várias vantagens:
- O fluxo em microcanais é laminar, o que permite o tratamento seletivo de células em microcanais, modelagem matemática de padrões e concentrações de fluxo , bem como previsões quantitativas do ambiente biológico das células e reações bioquímicas
- As características microfluídicas podem ser fabricadas na escala celular ou menor, o que permite a investigação de fenômenos (sub) celulares, semeadura e classificação de células individuais e recapitulação de parâmetros fisiológicos
- A integração de microeletrônica , micromecânica e microótica na mesma plataforma permite o controle de dispositivo automatizado , o que reduz erros humanos e custos de operação
- A tecnologia microfluídica é relativamente econômica devido à fabricação em lote e alto rendimento (paralelização e redundância). Isso permite a produção de chips descartáveis ou de uso único para maior facilidade de uso e probabilidade reduzida de contaminação biológica cruzada , bem como prototipagem rápida
- Dispositivos microfluídicos consomem quantidades muito menores de reagentes , podem ser feitos para exigir apenas uma pequena quantidade de analitos para detecção química, requerem menos tempo para processos e reações serem concluídos e produzem menos resíduos do que dispositivos macrofluídicos convencionais e experimentos
- O empacotamento apropriado de dispositivos microfluídicos pode torná-los adequados para aplicações vestíveis, implantes e aplicações portáteis em países em desenvolvimento
Uma abordagem interessante que combina fenômenos eletrocinéticos e microfluídica é a microfluídica digital . Na microfluídica digital, uma superfície de substrato é micropadronizada com eletrodos e ativada seletivamente. A manipulação de pequenas gotículas de fluido ocorre por eletrumedecimento , que é o fenômeno em que um campo elétrico altera a molhabilidade de uma gota de eletrólito em uma superfície.
Controle de fluxo de BioMEMs
Os métodos litográficos para a fabricação de dispositivos microfluídicos são ineficazes na formação dos mecanismos do tipo parafuso usados em válvulas em macroescala. Portanto, dispositivos microfluídicos requerem técnicas alternativas de controle de fluxo, algumas das quais são atualmente populares:
Válvulas de terremoto
Um método barato de produção de válvulas com tempos de atuação rápidos e restrição de fluxo variável é a litografia suave de multicamadas (MSL). As válvulas produzidas por meio dessa técnica de fabricação são chamadas de válvulas Quake, porque foram criadas pela primeira vez no laboratório de Stephen Quake na Universidade de Stanford . O esquema básico envolve dois condutos de fluxo perpendiculares separados por uma membrana elastomérica impermeável em sua intersecção. O fluxo de ar controlado passa por um conduíte enquanto o fluido do processo passa pelo outro. Um gradiente de pressão entre os dois conduítes, que é ajustado pela alteração da taxa de fluxo de ar de controle, faz com que a membrana se deforme e obstrua o fluxo no canal do processo. No MSL, os canais para o fluido de processo e o fluido de controle são vazados de um molde elastomérico , tornando-o um processo de fabricação totalmente aditivo.
Válvulas de Gelo
As válvulas de gelo operam transportando o calor para longe de uma única parte de um canal de fluxo, fazendo com que o fluido se solidifique e pare o fluxo naquela região. Unidades termoelétricas (TE) são usadas para transportar o calor para longe do plugue. Devido à diferença de temperatura limitada que as unidades TE podem fornecer, muitas vezes são encadeados em série para produzir temperaturas abaixo de zero na interface fluido-substrato, permitindo um resfriamento mais rápido. A tecnologia de válvula de gelo de última geração apresenta tempos de fechamento curtos (0,37 s a 10 μL / min) e também opera em altas taxas de fluxo (1150 μL / min). As válvulas de gelo foram introduzidas pela primeira vez em 1995, onde dióxido de carbono líquido pressurizado foi usado como agente de resfriamento.
Válvulas pré-fabricadas
Válvulas de parafuso mecânicas pré-fabricadas e válvulas solenóides não requerem processos de microfabricação avançados e são fáceis de implementar em materiais de substrato macio como PDMS . Válvulas de parafuso, ao contrário das válvulas Quake e gelo, mantêm seu nível de restrição de fluxo sem entrada de energia e, portanto, são ideais para situações em que a posição da válvula pode permanecer quase constante e a atuação por um operador humano é aceitável. As válvulas solenóides eletromagnéticas têm tempos de atuação semelhantes em comparação com as válvulas Quake, mas têm pegadas maiores e não são integradas ao substrato do dispositivo. Este é um problema quando as dimensões do dispositivo são um problema, como em dispositivos implantáveis.
Mistura em microescala
Apesar do fato de que os tempos de difusão são significativamente mais curtos em sistemas microfluídicos devido a pequenas escalas de comprimento, ainda existem desafios para remover gradientes de concentração nas escalas de tempo necessárias para tecnologias microfluídicas.
Elementos de mistura de sonicação
A sonicação é freqüentemente empregada para fornecer mistura local de fluxos por meio da geração de acústica de energia ultra-alta. Os chips microfluídicos que utilizam a mistura de sonicação podem ter transdutores ultrassônicos integrados e localizados externamente. A sonicação também é amplamente usada para lise e homogeneização celular em sistemas macro e microfluídicos. O principal mecanismo de lise celular por sonicação é o intenso aquecimento local e forças de cisalhamento .
Elementos de mistura passivos
Em um elemento de mistura passivo, a mistura é obtida pela redistribuição temporal e espacial do fluxo laminar de entrada por meio do uso de conduítes paralelos de comprimento e / ou diâmetro de caminho variável. O resultado líquido de ter uma variedade de canais de fluxo paralelos de comprimento variável é que o material inicialmente na borda do perfil de fluxo laminar pode ser repetidamente redistribuído para a borda oposta, encurtando assim drasticamente a escala de comprimento de difusão característica.
Bio-MEMS como biossensores miniaturizados
Biossensores são dispositivos que consistem em um sistema de reconhecimento biológico, chamado bioreceptor, e um transdutor . A interação do analito com o bioreceptor causa um efeito que o transdutor pode converter em uma medição, como um sinal elétrico . Os bioreceptores mais comuns usados no biossensorio baseiam-se em interações anticorpo-antígeno , interações de ácido nucléico, interações enzimáticas , interações celulares e interações usando materiais biomiméticos . As técnicas de transdutor comuns incluem detecção mecânica, detecção elétrica e detecção óptica.
Sensores micromecânicos
A detecção mecânica em bio-MEMS é obtida por meio de cantiléveres em escala micro e nano para detecção de tensão e de massa, ou placas ou membranas em escala micro e nano. Na detecção de tensão, a reação bioquímica é realizada seletivamente em um lado do cantilever para causar uma mudança na energia livre da superfície . Isso resulta na flexão do cantilever que é mensurável opticamente ( reflexão do laser em um detector de quadposition) ou eletricamente ( piezo-resistor na borda fixa do cantilever) devido a uma mudança na tensão da superfície. Na detecção de massa, o cantilever vibra em sua frequência ressonante medida eletricamente ou opticamente. Quando uma reação bioquímica ocorre e é capturada no cantilever, a massa do cantilever muda, assim como a frequência de ressonância. A análise desses dados pode ser um pouco menos direta, no entanto, já que a adsorção da amostra ao cantilever também alterou o módulo de Young do cantilever. Alterar a rigidez do cantilever também mudará sua frequência de ressonância e, portanto, o ruído no sinal de oscilação deve ser analisado para determinar se a frequência de ressonância também é uma função da alteração da elasticidade. Um uso comum para essa técnica é na detecção de incompatibilidades de nucleotídeos no DNA porque a variação na massa causada pela presença de uma base incorreta é suficiente para alterar a frequência ressonante do cantilever e registrar um sinal. A detecção de massa não é tão eficaz em fluidos porque a massa mínima detectável é muito maior em meios amortecidos . Resistores de microcanais suspensos são um tipo especial de projeto cantilever que pode contornar essa limitação usando canais microfluídicos dentro do cantilever. Esses canais podem mover amostras '' in situ '' ao redor do cantilever, sem submergir o cantilever, impactando minimamente em sua oscilação. No entanto, essa tecnologia está em sua infância e ainda não pode ser usada além de algumas poucas aplicações limitadas. A vantagem de usar sensores cantilever é que não há necessidade de um rótulo opticamente detectável no analito ou bioreceptores.
Sensores elétricos e eletroquímicos
A detecção elétrica e eletroquímica é facilmente adaptada para portabilidade e miniaturização , especialmente em comparação com a detecção óptica. Em biossensores amperométricos , uma reação redox catalisada por enzima causa uma corrente de elétrons redox que é medida por um eletrodo de trabalho. Biossensores amperométricos têm sido usados em bio-MEMS para detecção de glicose , galactose , lactose , uréia e colesterol , bem como para aplicações em detecção de gás e hibridização de DNA . Em biossensores potenciométricos , as medições do potencial elétrico em um eletrodo são feitas em referência a outro eletrodo. Exemplos de biossensores potenciométricos incluem transistores de efeito de campo sensíveis a íons (ISFET) , transistores de efeito de campo químico (chem-FET) e sensores potenciométricos endereçáveis à luz (LAPS) . Em condutométricas biossensores , alterações na impedância eléctrica entre dois eléctrodos são medidos como resultado de uma reacção biomolecular. As medições condutivas são simples e fáceis de usar porque não há necessidade de um eletrodo de referência específico e têm sido usadas para detectar produtos bioquímicos, toxinas , ácidos nucléicos e células bacterianas .
Sensores Ópticos
Um desafio na detecção óptica é a necessidade de integrar detectores e fotodiodos em um formato portátil miniaturizado no bio-MEMS. A detecção óptica inclui técnicas baseadas em fluorescência , técnicas baseadas em quimioluminescência e ressonância plasmônica de superfície (SPR) . Técnicas ópticas baseadas em fluorescência usam marcadores que emitem luz em comprimentos de onda específicos e a presença ou aumento / redução (por exemplo, transferência de energia de ressonância de fluorescência ) no sinal óptico indica que uma reação ocorreu. A detecção baseada em fluorescência tem sido usada em microarrays e PCR em dispositivos de chip. A quimiluminescência é a geração de luz pela liberação de energia de uma reação química. Bioluminescência e eletroquimioluminescência são subtipos de quimioluminescência. Os sensores de ressonância de plasmon de superfície podem ser refratômetros de filme fino ou grades que medem o comportamento de ressonância do plasmon de superfície em superfícies de metal ou dielétricas. A ressonância muda quando as biomoléculas são capturadas ou adsorvidas na superfície do sensor e depende da concentração do analito, bem como de suas propriedades. A ressonância plasmônica de superfície tem sido usada em análises de qualidade e segurança de alimentos , diagnósticos médicos e monitoramento ambiental .
Bio-MEMS para diagnósticos
Microarrays genômicos e proteômicos
Os objetivos dos microarrays genômicos e proteômicos são tornar a análise do genoma de alto rendimento mais rápida e barata, bem como identificar genes ativados e suas sequências. Existem muitos tipos diferentes de entidades biológicas usadas em microarrays, mas em geral o microarray consiste em uma coleção ordenada de microarray, cada um contendo uma única espécie molecular definida que interage com o analito para testes simultâneos de milhares de parâmetros em um único experimento. Algumas aplicações de microarranjos genômicos e proteômicos são a triagem neonatal , a identificação do risco de doenças e a previsão da eficácia da terapia para medicina personalizada .
Chips de oligonucleotídeo
Os chips de oligonucleotídeos são microarrays de oligonucleotídeos . Eles podem ser usados para detecção de mutações e monitoramento de expressão e descoberta e mapeamento de genes. Os principais métodos para criar um microarray de oligonucleotídeo são por almofadas de gel ( Motorola ), microeletrodos (Nanogen), fotolitografia ( Affymetrix ) e tecnologia de jato de tinta ( Agilent ).
- Usando almofadas de gel, oligonucleotídeos pré-fabricados são fixados a adesivos de poliacrilamida ativada
- Usando microeletrodos , DNA com carga negativa e sondas moleculares podem ser concentrados em eletrodos energizados para interação
- Usando fotolitografia, um padrão de exposição à luz é criado no substrato usando uma fotomáscara ou fotomáscara virtual projetada de um dispositivo de microespelho digital . A luz remove os grupos de proteção fotoliabilizáveis das áreas de exposição selecionadas. Após a desprotecção, os nucleotídeos com um grupo protetor fotolábil são expostos a toda a superfície e o processo de acoplamento químico ocorre apenas onde a luz foi exposta na etapa anterior. Este processo pode ser repetido para sintetizar oligonucleotídeos de comprimentos relativamente curtos na superfície, nucleotídeo por nucleotídeo.
- Usando a tecnologia de jato de tinta, os nucleotídeos são impressos em uma superfície gota a gota para formar oligonucleotídeos
cDNA microarray
Os microarranjos de cDNA são frequentemente usados para triagem em larga escala e estudos de expressão. Em cDNA microarrays, mRNA de células são coletados e convertidos em cDNA por transcrição reversa. Posteriormente, as moléculas de cDNA (cada uma correspondendo a um gene) são imobilizadas como manchas de ~ 100 µm de diâmetro em uma membrana, vidro ou chip de silício por pinos metálicos. Para a detecção, o cDNA de fita simples marcado com fluorescência de células hibridiza com as moléculas no microarray e uma comparação diferencial entre uma amostra tratada (marcada em vermelho, por exemplo) e uma amostra não tratada (marcada em outra cor, como verde) é usada para análise . Os pontos vermelhos significam que o gene correspondente foi expresso em um nível superior na amostra tratada. Por outro lado, os pontos verdes significam que o gene correspondente foi expresso em um nível mais alto na amostra não tratada. Os pontos amarelos, como resultado da sobreposição entre os pontos vermelhos e verdes, significam que o gene correspondente foi expresso relativamente ao mesmo nível em ambas as amostras, ao passo que os pontos escuros indicam nenhuma expressão ou expressão insignificante em qualquer das amostras.
Microarrays de peptídeos e proteínas
A motivação para o uso de microarrays de peptídeos e proteínas é, em primeiro lugar, porque os transcritos de mRNA freqüentemente se correlacionam mal com a quantidade real de proteína sintetizada. Em segundo lugar, os microarranjos de DNA não podem identificar a modificação pós-tradução de proteínas, o que influencia diretamente a função da proteína. Em terceiro lugar, alguns fluidos corporais, como a urina, não possuem mRNA . Um microarray de proteínas consiste em uma biblioteca de proteínas imobilizada em um chip de substrato, geralmente vidro, silício, poliestireno , PVDF ou nitrocelulose . Em geral, existem três tipos de microarrays de proteínas: funcionais, analíticos ou de captura e arranjos de proteínas de fase reversa.
- Matrizes de proteínas funcionais exibem proteínas ativas e dobradas e são usadas para triagem de interações moleculares, estudo de vias de proteínas, identificação de alvos para modificação pós-tradução e análise de atividades enzimáticas .
- Matrizes de proteínas analíticas ou de captura exibem antígenos e anticorpos para traçar o perfil da expressão de proteínas ou anticorpos no soro. Essas matrizes podem ser usadas para descoberta de biomarcadores , monitoramento de quantidades de proteínas, monitoramento de estados de atividade em vias de sinalização e criação de perfil de repertórios de anticorpos em doenças.
- Matrizes de proteínas de fase reversa testam réplicas de lisados celulares e amostras de soro com diferentes anticorpos para estudar as mudanças na expressão de proteínas específicas e modificações de proteínas durante a progressão da doença, bem como a descoberta de biomarcadores .
Os microarrays de proteínas têm produção, armazenamento e condições experimentais rigorosas devido à baixa estabilidade e necessidade de considerar o dobramento nativo nas proteínas imobilizadas. Os peptídeos, por outro lado, são mais resistentes quimicamente e podem reter aspectos parciais da função da proteína. Como tal, microarrays de peptídeos têm sido usados para complementar microarrays de proteínas em pesquisas e diagnósticos de proteômica. Os microarranjos de proteínas geralmente usam Escherichia coli para produzir proteínas de interesse; enquanto os microarranjos de peptídeos usam a técnica SPOT (síntese em etapas de peptídeos em celulose) ou fotolitografia para produzir peptídeos.
Chips de PCR
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica fundamental de biologia molecular que permite a amplificação seletiva de sequências de DNA , que é útil para o uso expandido de amostras raras, por exemplo: células-tronco, biópsias, células tumorais circulantes. A reação envolve o ciclo térmico da sequência de DNA e da DNA polimerase em três temperaturas diferentes. O aquecimento e o resfriamento em dispositivos de PCR convencionais são demorados e as reações de PCR típicas podem levar horas para serem concluídas. Outras desvantagens da PCR convencional são o alto consumo de reagentes caros, a preferência por amplificar fragmentos curtos e a produção de moléculas quiméricas curtas. Os chips de PCR servem para miniaturizar o ambiente de reação para obter uma rápida transferência de calor e mistura rápida devido à maior razão superfície-volume e distâncias de difusão curtas. As vantagens dos chips de PCR incluem menor tempo de ciclo térmico, temperatura mais uniforme que aumenta o rendimento e portabilidade para aplicações em pontos de atendimento. Dois desafios em chips microfluídicos de PCR são a inibição e contaminação da PCR devido à grande proporção superfície-volume que aumenta as interações reagente-superfície. Por exemplo, substratos de silício têm boa condutividade térmica para aquecimento e resfriamento rápidos, mas podem envenenar a reação da polimerase. Os substratos de silício também são opacos, proibindo a detecção óptica para qPCR, e eletricamente condutores, evitando o transporte eletroforético através dos canais. Enquanto isso, o vidro é um material ideal para eletroforese, mas também inibe a reação. Polímeros, particularmente PDMS , são opticamente transparentes, não inibidores, e podem ser usados para revestir um canal de vidro eletroforético. Vários outros tratamentos de superfície também existem, incluindo polietilenoglicol, albumina de soro bovino e dióxido de silício. Existem arquiteturas de chip estacionário (baseado em câmara), dinâmico (baseado em fluxo contínuo) e microgotículas ( PCR digital ).
- A arquitetura baseada em câmara é o resultado da redução dos reatores de PCR convencionais, o que é difícil de aumentar. Um dispositivo PDMS de vidro de quatro camadas foi desenvolvido usando essa arquitetura integrando microválvulas, microaquecedores, sensores de temperatura, câmaras de reação de 380 nL e canais de eletroforese capilar para reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) que tem sensibilidade de detecção attomolar .
- A arquitetura baseada em fluxo contínuo move a amostra através de diferentes zonas de temperatura para atingir o ciclo térmico . Essa abordagem usa menos energia e tem alto rendimento, mas tem grande consumo de reagente e bolhas de gás podem se formar dentro dos canais de fluxo.
- O PCR digital elimina a adsorção e a contaminação da superfície da amostra / reagente ao realizar o PCR em microgotículas ou microcâmaras. A PCR em gotículas também evita a recombinação de fragmentos de genes homólogos, de forma que a síntese de produtos quiméricos curtos é eliminada.
Dispositivos de diagnóstico de ponto de atendimento
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A capacidade de realizar diagnósticos médicos à beira do leito ou no local de atendimento é importante na assistência à saúde, especialmente em países em desenvolvimento, onde o acesso a hospitais centralizados é limitado e proibitivamente caro. Para este fim, os bio-MEMS de diagnóstico de ponto de atendimento foram desenvolvidos para coletar amostras de saliva, sangue ou urina e, em uma abordagem integrada, realizar o pré-condicionamento da amostra, o fracionamento da amostra, a amplificação do sinal, a detecção do analito, a análise dos dados e a exibição dos resultados. Em particular, o sangue é uma amostra biológica muito comum porque circula pelo corpo a cada poucos minutos e seu conteúdo pode indicar muitos aspectos da saúde.
Condicionamento de amostra
Na análise de sangue, os leucócitos , plaquetas , bactérias e plasma devem ser separados. Peneiras, barreiras, confinamento inercial e dispositivos de desvio de fluxo são algumas abordagens usadas na preparação do plasma sanguíneo para análise livre de células. As peneiras podem ser microfabricadas com colunas ou postes de alta relação de aspecto, mas são adequadas apenas para carregamento baixo para evitar o entupimento com células. Barragens são seções rasas semelhantes a mesas usadas para restringir o fluxo a fendas estreitas entre camadas sem postes. Uma vantagem de usar barreiras é que a ausência de postes permite a reciclagem mais eficaz do retenato para o fluxo através do filtro para lavar as células entupidas. Contas magnéticas são usadas para auxiliar na separação do analito. Essas contas microscópicas são funcionalizadas com moléculas-alvo e movidas através de canais microfluídicos usando um campo magnético variável. Isso serve como um método rápido de coleta de alvos para análise. Após a conclusão desse processo, um forte campo magnético estacionário é aplicado para imobilizar os grânulos ligados ao alvo e lavar os grânulos não ligados. O filtro H é um dispositivo microfluídico com duas entradas e duas saídas que aproveita o fluxo laminar e a difusão para separar os componentes que se difundem pela interface entre dois fluxos de entrada. Ao controlar a taxa de fluxo, a distância de difusão e o tempo de residência do fluido no filtro, as células são excluídas do filtrado em virtude de sua taxa de difusão mais lenta. O filtro H não entope e pode funcionar indefinidamente, mas os analitos são diluídos por um fator de dois. Para análise de células, as células podem ser estudadas intactas ou após a lise . Um fluxo de tampão lítico pode ser introduzido ao lado de um fluxo contendo células e por difusão induz a lise antes de uma análise posterior. A análise de células é normalmente feita por citometria de fluxo e pode ser implementada em microfluídicos com velocidades de fluido mais baixas e menor rendimento do que suas contrapartes macroscópicas convencionais.
Fracionamento da amostra
A separação microfluídica da amostra pode ser realizada por eletroforese capilar ou separação de fluxo contínuo. Na eletroforese capilar, um tubo longo e fino separa os analitos por voltagem conforme eles migram por fluxo eletro-osmótico . Para separação de fluxo contínuo, a ideia geral é aplicar um campo em um ângulo com a direção do fluxo para desviar o caminho do fluxo de amostra em direção a diferentes canais. Exemplos de técnicas de separação de fluxo contínuo incluem eletroforese de fluxo contínuo, focagem isoelétrica , separações magnéticas de fluxo contínuo e peneiramento molecular .
Desafios pendentes
- A maioria dos dispositivos de diagnóstico no mercado pode testar apenas uma doença. Além disso, a maioria dos dispositivos tem saída binária (sim / não) sem informações diferenciadas sobre a condição do paciente. Assim, além de desenvolver testes para mais doenças, os cientistas trabalham atualmente para ampliar a complexidade desses aparelhos, a fim de aumentar sua utilidade.
- É difícil fabricar dispositivos de diagnóstico MEMS fora do ambiente de laboratório. Grande parte da pesquisa sobre esses dispositivos ocorre em laboratórios climatizados, onde os dispositivos podem ser testados logo após serem produzidos. No entanto, como muitos desses dispositivos são usados para detectar doenças tropicais, eles devem ser robustos o suficiente para sobreviver em condições de calor e umidade. Eles também devem ser armazenados por longos períodos, desde o momento da produção até o momento do uso.
- O financiamento é escasso para a pesquisa de doenças tropicais. Além disso, existem muitos obstáculos regulatórios que devem ser eliminados antes que um dispositivo médico seja aprovado, o que pode custar dezenas de milhões de dólares. Assim, as empresas que se concentram em doenças tropicais devem frequentemente combinar seus objetivos de pesquisa para doenças tropicais com pesquisas em outras áreas de pesquisa médica mais bem financiadas.
Bio-MEMS em engenharia de tecidos
Cultura de células
A tecnologia de cultura de células convencional é incapaz de permitir testes combinatórios de candidatos a drogas, fatores de crescimento , neuropeptídeos , genes e retrovírus em meio de cultura de células. Devido à necessidade de as células serem alimentadas periodicamente com meio fresco e passadas, mesmo o teste de algumas condições requer um grande número de células e suprimentos, incubadoras caras e volumosas , grandes volumes de fluido (~ 0,1 - 2 mL por amostra) e tedioso trabalho humano. A necessidade de trabalho humano também limita o número e a duração entre os pontos de tempo para experimentos. As culturas de células microfluídicas são potencialmente uma grande melhoria porque podem ser automatizadas, bem como produzir um custo geral mais baixo, maior rendimento e descrições mais quantitativas da variabilidade do comportamento de uma única célula. Ao incluir sistemas de troca de gás e controle de temperatura no chip, a cultura de células microfluídicas pode eliminar a necessidade de incubadoras e capelas de cultura de tecidos . No entanto, este tipo de operação contínua de cultura de células microfluídicas também apresenta seus próprios desafios. O controle de fluxo é importante ao semear células em microcanais porque o fluxo precisa ser interrompido após a injeção inicial da suspensão de células para que as células se fixem ou fiquem presas em micropoços, armadilhas dieletroforéticas, armadilhas micromagnéticas ou armadilhas hidrodinâmicas. Posteriormente, o fluxo precisa ser retomado de uma forma que não produza grandes forças que separem as células do substrato. A distribuição de fluidos por pipetagem manual ou robótica pode ser substituída por microbombas e microválvulas, onde a dosagem de fluido é direta de determinar, em oposição aos sistemas de fluxo contínuo por micromisturadores. Um sistema de cultura de células microfluídicas totalmente automatizado foi desenvolvido para estudar a diferenciação osteogênica de células-tronco embrionárias humanas . Uma incubadora de cultura de células microfluídicas portátil capaz de aquecer e bombear soluções de cultura de células também foi desenvolvida. Devido à redução de volume em culturas microfluídicas , as concentrações coletadas são mais altas para melhores medições da razão sinal-ruído , mas a coleta e a detecção são correspondentemente mais difíceis. Ensaios de microscopia '' in situ '' com culturas de células microfluídicas podem ajudar nesse sentido, mas têm um rendimento inerentemente menor devido à sonda de microscópio ter apenas um pequeno campo de visão. A plataforma Berkeley Lights Beacon resolveu o problema de coleta e detecção realizando cultura microfluídica em uma série de fotocondutores que podem ser optoeletricamente ativados para manipular células através do chip. Esta plataforma foi adotada pela Amgen e Novartis para o desenvolvimento de linha de células na indústria biofarmacêutica. As co-culturas micropadronizadas também contribuíram para bio-MEMS para a engenharia de tecidos para recapitular as condições in vivo e a estrutura natural 3D. Especificamente, os hepatócitos foram padronizados para co-cultura em densidades celulares específicas com fibroblastos para manter funções específicas do fígado , como secreção de albumina , síntese de ureia e desintoxicação de p450 . Da mesma forma, a integração da microfluídica com co-culturas micropadronizadas possibilitou a modelagem de órgãos onde múltiplos tecidos vascularizados fazem interface, como a barreira hematoencefálica e os pulmões. As funções pulmonares em nível de órgão foram reconstituídas em dispositivos lung-on-a-chip onde uma membrana porosa e a camada de células epiteliais semeadas são ciclicamente esticadas por vácuo aplicado em microcanais adjacentes para imitar a inalação .
Engenharia de células-tronco
O objetivo da engenharia de células-tronco é ser capaz de controlar a diferenciação e auto-renovação de células-tronco de pluripotência para terapia celular . A diferenciação em células-tronco depende de muitos fatores, incluindo fatores solúveis e bioquímicos, estresse de cisalhamento de fluido , interações célula- ECM , interações célula-célula, bem como formação e organização do corpo embrioide . Bio-MEMS tem sido usado para pesquisar como otimizar a cultura e as condições de crescimento de células-tronco controlando esses fatores. O ensaio de células-tronco e sua progênie diferenciada é feito com microarrays para estudar como os fatores de transcrição e miRNAs determinam o destino celular, como as modificações epigenéticas entre as células-tronco e suas células-filhas afetam os fenótipos , bem como medir e classificar as células-tronco por sua expressão proteica.
Fatores bioquímicos
A microfluídica pode alavancar seu volume microscópico e características de fluxo laminar para controle espaço-temporal de fatores bioquímicos entregues às células-tronco. Geradores de gradiente microfluídico têm sido usados para estudar as relações dose-resposta . O oxigênio é um fator bioquímico importante a ser considerado na diferenciação por meio de fatores de transcrição induzidos por hipóxia (HIFs) e vias de sinalização relacionadas, mais notavelmente no desenvolvimento do sangue, vasculatura , placenta e tecidos ósseos. Os métodos convencionais de estudar os efeitos do oxigênio dependiam da configuração de toda a incubadora em uma determinada concentração de oxigênio, o que limitava a análise a comparações de pares entre as condições normóxicas e hipóxicas, em vez da caracterização dependente da concentração desejada. As soluções desenvolvidas incluem o uso de gradientes de oxigênio axiais contínuos e matrizes de câmaras de cultura de células microfluídicas separadas por membranas PDMS finas em microcanais cheios de gás .
Tensão de cisalhamento de fluido
O estresse de cisalhamento de fluido é relevante na diferenciação de células-tronco de linhagens cardiovasculares, bem como na embriogênese e organogênese tardia , como assimetria esquerda-direita durante o desenvolvimento. Os estudos em macroescala não permitem a análise quantitativa da tensão de cisalhamento para a diferenciação porque são realizados usando câmaras de fluxo de placa paralela ou aparelhos de cone rotativo apenas em cenários on-off. O fluxo de Poiseuille em microfluídica permite que as tensões de cisalhamento sejam sistematicamente variadas usando a geometria do canal e a taxa de fluxo por meio de microbombas , conforme demonstrado pelo uso de matrizes de câmaras de perfusão para células-tronco mesenquimais e estudos de adesão de células de fibroblastos .
Interações célula-ECM
As interações célula- ECM induzem mudanças na diferenciação e autorrenovação pela rigidez do substrato via mecanotransdução e diferentes integrinas interagindo com moléculas de ECM. Micropatterning de ECM proteínas por impressão de micro-contacto (μCP) , impressão de jacto de tinta , e uma máscara de pulverização têm sido utilizados em células estaminais - ECM estudos de interacção. Foi descoberto, usando impressão de micro-contato para controlar a área de fixação celular , que essa mudança na linhagem osteogênica / adipogênica em células-tronco mesenquimais humanas pode ser dependente da forma celular. A microfabricação de microposts e a medição de sua deflexão podem determinar as forças de tração exercidas nas células. A fotolitografia também pode ser usada para reticular ECM fotopolimerizável semeado com células para estudos tridimensionais. Usar microarrays ECM para otimizar os efeitos combinatórios de colágeno , laminina e fibronectina em células-tronco é mais vantajoso do que placas de poços convencionais devido ao seu maior rendimento e menor necessidade de reagentes caros.
Interações célula-célula
O destino da célula é regulado por ambas as interações entre as células-tronco e as interações entre as células-tronco e as proteínas de membrana . Manipular a densidade de semeadura celular é uma técnica biológica comum no controle das interações célula-célula , mas controlar a densidade local é difícil e muitas vezes é difícil dissociar os efeitos entre os sinais solúveis no meio e as interações físicas célula-célula. A micropadronização de proteínas de adesão celular pode ser usada na definição das posições espaciais de diferentes células em um substrato para estudar a proliferação de ESC humana. Semear células-tronco em micropoços PDMS e lançá-los em um substrato ou outra camada de células é um método de obter controle espacial preciso. As comunicações de junção de lacuna também foram estudadas usando microfluídica, em que a pressão negativa gerada pelo fluxo de fluido em canais laterais que flanqueiam um canal central captura pares de células que estão em contato direto ou separadas por uma pequena lacuna. No entanto, em geral, a motilidade diferente de zero e o tempo de ciclo celular curto das células-tronco frequentemente perturbam a organização espacial imposta por essas microtecnologias.
Formação e organização do corpo embrióide
Os corpos embrióides são um teste de pluripotência in vitro comum para células-tronco e seu tamanho precisa ser controlado para induzir a diferenciação direcionada a linhagens específicas. A formação de alto rendimento de corpos embrióides de tamanho uniforme com micropoços e microfluídicos permite uma fácil recuperação e, mais importante, escalonamento para contextos clínicos. O controle ativo da organização e arquitetura das células do corpo embrióide também pode direcionar a diferenciação das células-tronco usando gradientes microfluídicos de endoderme -, mesoderme - e fatores indutores de ectoderma , bem como fatores de autorrenovação.
Tecnologias de reprodução assistida
As tecnologias de reprodução assistida ajudam a tratar a infertilidade e melhorar geneticamente o gado. No entanto, a eficiência dessas tecnologias na criopreservação e na produção in vitro de embriões de mamíferos é baixa. A microfluídica tem sido aplicada nessas tecnologias para imitar melhor o microambiente in vivo com superfícies topográficas e bioquímicas padronizadas para adesão celular espaço-temporal controlada, bem como minimização de volumes mortos. Microbombas e microválvulas podem automatizar procedimentos tediosos de dispensação de fluidos e vários sensores podem ser integrados para controle de qualidade em tempo real . Dispositivos Bio-MEMS foram desenvolvidos para avaliar a motilidade espermática , realizar a seleção espermática , bem como prevenir a polispermia na fertilização in vitro .
Bio-MEMS em implantes médicos e cirurgia
Microeletrodos implantáveis
O objetivo dos microeletrodos implantáveis é fazer a interface com o sistema nervoso do corpo para registrar e enviar sinais bioelétricos para estudar doenças, melhorar próteses e monitorar parâmetros clínicos . A microfabricação levou ao desenvolvimento de sondas Michigan e do arranjo de eletrodos de Utah , que aumentaram os eletrodos por unidade de volume, ao mesmo tempo em que tratam de problemas de substratos espessos que causam danos durante a implantação e desencadeiam reação de corpo estranho e encapsulamento de eletrodo via silício e metais nos eletrodos. As sondas de Michigan foram usadas em gravações em grande escala e análise de rede de conjuntos neuronais, e o arranjo de eletrodos de Utah foi usado como uma interface cérebro-computador para paralisados. Microeletrodos extracelulares foram padronizados em um plástico inflável em forma de hélice em implantes cocleares para melhorar a inserção mais profunda e melhor contato eletrodo-tecido para transdução de sons de alta fidelidade. A integração da microeletrônica em substratos finos e flexíveis levou ao desenvolvimento de um patch cardíaco que adere à superfície curvilínea do coração apenas pela tensão superficial para medir eletrofisiologia cardíaca e tatuagens eletrônicas para medir a temperatura da pele e bioeletricidade . A gravação sem fio de sinais eletrofisiológicos é possível através da adição de um piezocristal a um circuito de dois eletrodos de gravação e um único transistor em um microdispositivo implantado. Um transdutor externo emite pulsos de energia ultrassônica} que colidem com o piezocristal, e as alterações de voltagem extracelular são retroespalhadas por ultrassom pelo piezocristal, permitindo a medição. Uma rede dos chamados ciscos de "poeira neural" pode mapear sinais por toda a região do corpo onde os microssensores são implantados.
Microferramentas para cirurgia
Bio-MEMS para aplicações cirúrgicas pode melhorar a funcionalidade existente, adicionar novos recursos para os cirurgiões desenvolverem novas técnicas e procedimentos e melhorar os resultados cirúrgicos reduzindo o risco e fornecendo feedback em tempo real durante a operação. Ferramentas cirúrgicas micro-cromadas, como pinças minúsculas , arranjos de microagulhas e debridadores de tecido, tornaram-se possíveis por meio de técnicas de microfabricação camada por camada de metal e cerâmica para cirurgia minimamente invasiva e cirurgia robótica . A incorporação de sensores em ferramentas cirúrgicas também permite feedback tátil para o cirurgião, identificação do tipo de tecido por meio de tensão e densidade durante as operações de corte e cateterismo diagnóstico para medir fluxos sanguíneos , pressões, temperaturas , conteúdo de oxigênio e concentrações químicas.
Entrega de drogas
Microagulhas, sistemas de formulação e sistemas implantáveis são bio-MEMS aplicáveis à distribuição de drogas . Microagulhas de aproximadamente 100μm podem penetrar a barreira da pele e fornecer medicamentos às células subjacentes e ao fluido intersticial com redução do dano ao tecido, redução da dor e ausência de sangramento. As microagulhas também podem ser integradas à microfluídica para carregamento automático de medicamentos ou multiplexação. Do ponto de vista do usuário, as microagulhas podem ser incorporadas em um formato de patch para auto-administração e não constituem um resíduo de risco biológico acentuado (se o material for polimérico ). A distribuição de drogas por microagulhas inclui o revestimento da superfície com agentes terapêuticos, carregamento de drogas em microagulhas porosas ou ocas, ou fabricação de microagulhas com droga e matriz de revestimento para carga máxima de droga. Microagulhas para extração de fluido intersticial, extração de sangue e entrega de genes também estão sendo desenvolvidas. A eficiência da administração de medicamentos com microagulhas permanece um desafio porque é difícil verificar se as microagulhas penetraram efetivamente na pele. Alguns medicamentos, como o diazepam , são pouco solúveis e precisam ser aerossolizados imediatamente antes da administração intranasal . A tecnologia Bio-MEMS usando transdutores piezoelétricos para reservatórios de líquido pode ser usada nessas circunstâncias para gerar uma distribuição de tamanho estreita de aerossóis para uma melhor distribuição de drogas. Os sistemas de entrega de drogas implantáveis também foram desenvolvidos para administrar agentes terapêuticos que têm baixa biodisponibilidade ou requerem liberação localizada e exposição em um local alvo. Os exemplos incluem um dispositivo microfluídico PDMS implantado sob a conjuntiva para administração de drogas ao olho para tratar doenças oculares e microchips com reservatórios de drogas com tampa de ouro para osteoporose . Em bio-MEMS implantáveis para entrega de drogas, é importante considerar a ruptura do dispositivo e descarte de dose , encapsulamento fibroso do dispositivo e explantação do dispositivo. A maioria dos medicamentos também precisa ser entregue em quantidades relativamente grandes (mililitros ou até maiores), o que torna a entrega de medicamentos de bio-MEMS implantáveis desafiadora devido à sua capacidade limitada de retenção de medicamentos.