Ensaio - Assay

Um ensaio é um procedimento investigativo (analítico) em medicina laboratorial , mineração , farmacologia , biologia ambiental e biologia molecular para avaliar qualitativamente ou medir quantitativamente a presença, quantidade ou atividade funcional de uma entidade alvo. O analito pode ser um fármaco , substância bioquímica , elemento ou composto químico ou célula de um organismo ou amostra orgânica . A entidade medida é freqüentemente chamada de analito , mensurando ou alvo do ensaio. Um ensaio geralmente visa medir a propriedade intensiva de um analito e expressá-la na unidade de medição relevante (por exemplo , molaridade , densidade , atividade funcional em unidades internacionais de enzima, grau de efeito em comparação com um padrão, etc.).

Se o ensaio envolver reagentes exógenos (os reagentes ), então suas quantidades são mantidas fixas (ou em excesso) de forma que a quantidade e a qualidade do alvo sejam os únicos fatores limitantes. A diferença no resultado do ensaio é usada para deduzir a qualidade ou quantidade desconhecida do alvo em questão. Alguns ensaios (por exemplo, ensaios bioquímicos) podem ser semelhantes à análise química e titulação . No entanto, os ensaios normalmente envolvem material biológico ou fenômenos que são intrinsecamente mais complexos em composição ou comportamento, ou ambos. Assim, a leitura de um ensaio pode ser ruidosa e envolver maiores dificuldades de interpretação do que uma titulação química precisa. Por outro lado, os ensaios qualitativos da geração mais antiga, especialmente os bioensaios , podem ser muito mais grosseiros e menos quantitativos (por exemplo, contando a morte ou disfunção de um organismo ou células em uma população, ou alguma mudança descritiva em alguma parte do corpo de um grupo de animais )

Os ensaios tornaram-se parte da rotina da moderna tecnologia médica , ambiental , farmacêutica e forense . Outras empresas também podem empregá-los nos níveis industrial , de calçada ou de campo. Os ensaios em alta demanda comercial têm sido bem investigados nos setores de pesquisa e desenvolvimento de indústrias profissionais. Eles também passaram por gerações de desenvolvimento e sofisticação. Em alguns casos, eles são protegidos por regulamentos de propriedade intelectual , como patentes concedidas para invenções . Tais ensaios em escala industrial são frequentemente realizados em laboratórios bem equipados e com organização automatizada do procedimento, desde a solicitação de um ensaio até o processamento pré-analítico da amostra (coleta de amostra, manipulações necessárias, por exemplo, centrifugação para separação , alíquota se necessário, armazenamento, recuperação, pipetagem , aspiração , etc.). Os analitos são geralmente testados em analisadores automáticos de alto rendimento e os resultados são verificados e devolvidos automaticamente aos provedores de serviço de pedidos e usuários finais . Isso é possível através do uso de um sistema de informática de laboratório avançado que faz interface com vários terminais de computador com usuários finais, servidores centrais , instrumentos de análise automática física e outros autômatos.

Etimologia

De acordo com o Etymology Online, o verbo ensaio significa "tentar, se esforçar, se esforçar, testar a qualidade de"; do anglo-francês assaier , do assai (substantivo), do francês antigo essai , "julgamento". Assim, o substantivo ensaio significa "ensaio, teste de qualidade, teste de caráter" (a partir de meados do século 14), do assai anglo-francês ; e seu significado "análise" é do final do século XIV.

Para análise de moedas, isso significava literalmente a análise da pureza do ouro ou da prata (ou de qualquer componente precioso) que representava o verdadeiro valor da moeda. Isso pode ter se traduzido mais tarde (possivelmente após o século 14) em um uso mais amplo de "análise", por exemplo, em farmacologia, análise de um componente importante de um alvo dentro de uma mistura - como o ingrediente ativo de um medicamento dentro dos excipientes inertes em uma formulação que anteriormente era medida apenas grosseiramente por sua ação observável em um organismo (por exemplo, uma dose letal ou uma dose inibitória).

Passos gerais

Um ensaio (análise) nunca é um processo isolado, pois deve ser acompanhado de procedimentos pré e pós-analíticos. Tanto a ordem de comunicação (a solicitação para realizar um ensaio mais informações relacionadas) e o manuseio da própria amostra (a coleta, documentação, transporte e processamento feito antes do início do ensaio) são etapas pré-analíticas. Da mesma forma, após a conclusão do ensaio, os resultados devem ser documentados, verificados e comunicados - as etapas pós-analíticas. Como acontece com qualquer sistema de transmissão e manipulação de informações em várias etapas , a variação e os erros no relatório dos resultados finais envolvem não apenas aqueles intrínsecos ao próprio ensaio, mas também aqueles que ocorrem nos procedimentos pré-analíticos e pós-analíticos.

Embora as etapas analíticas do ensaio em si recebam muita atenção, são aquelas que recebem menos atenção da cadeia de usuários - os procedimentos pré-analíticos e pós-analíticos - que normalmente acumulam a maioria dos erros; por exemplo, as etapas pré-analíticas em ensaios de laboratório médico podem contribuir com 32-75% de todos os erros de laboratório.

Os ensaios podem ser muito diversos, mas geralmente envolvem as seguintes etapas gerais:

  1. Processamento e manipulação de amostras a fim de apresentar seletivamente o alvo em uma forma discernível ou mensurável para um sistema de discriminação / identificação / detecção. Pode envolver uma simples separação centrífuga ou lavagem ou filtração ou captura por alguma forma de ligação seletiva ou pode até mesmo envolver a modificação do alvo, por exemplo, recuperação de epítopo em ensaios imunológicos ou corte do alvo em pedaços, por exemplo, em Espectrometria de Massa . Geralmente, há várias etapas separadas realizadas antes de um ensaio e são chamadas de processamento pré-analítico. Mas algumas das manipulações podem ser parte inseparável do próprio ensaio e não serão, portanto, consideradas pré-analíticas.
  2. Princípio de DISCRIMINAÇÃO / IDENTIFICAÇÃO específica do alvo : para discriminar do fundo (ruído) de componentes semelhantes e identificar especificamente um componente alvo específico ("analito") em um material biológico por seus atributos específicos. (por exemplo, em um ensaio de PCR, um iniciador de oligonucleotídeo específico identifica o alvo por emparelhamento de bases com base na sequência de nucleotídeos específica única para o alvo).
  3. Sistema de AMPLIFICAÇÃO de sinal (ou alvo) : A presença e quantidade desse analito é convertida em um sinal detectável geralmente envolvendo algum método de amplificação de sinal, de modo que possa ser facilmente discriminado do ruído e medido - por exemplo, em um ensaio de PCR entre uma mistura de Seqüências de DNA apenas o alvo específico é amplificado em milhões de cópias por uma enzima DNA polimerase para que possa ser discernida como um componente mais proeminente em comparação com quaisquer outros componentes potenciais. Às vezes, a concentração do analito é muito grande e, nesse caso, o ensaio pode envolver a diluição da amostra ou algum tipo de sistema de diminuição de sinal que é uma amplificação negativa.
  4. Sistema de DETECÇÃO (e interpretação) de sinais : Um sistema de decifrar o sinal amplificado em uma saída interpretável que pode ser quantitativa ou qualitativa. Podem ser métodos visuais ou manuais muito rudimentares ou podem ser detectores eletrônicos digitais ou analógicos muito sofisticados.
  5. O aprimoramento do sinal e a filtragem de ruído podem ser feitos em qualquer uma ou em todas as etapas acima. Uma vez que quanto mais a jusante uma etapa / processo durante um ensaio, maior a chance de transportar o ruído do processo anterior e amplificá-lo, várias etapas em um ensaio sofisticado podem envolver vários meios de arranjos de nitidez / aprimoramento específicos de sinal e redução de ruído ou arranjos de filtragem. Estes podem ser simplesmente na forma de um filtro óptico de passagem de banda estreita , ou um reagente de bloqueio em uma reação de ligação que impede a ligação não específica ou um reagente de extinção em um sistema de detecção de fluorescência que evita a "autofluorescência" de objetos de fundo.

Tipos de ensaio com base na natureza do processo de ensaio

Tempo e número de medições feitas

Dependendo se um ensaio olha apenas para um único ponto no tempo ou leituras temporizadas feitas em vários pontos no tempo, um ensaio pode ser:

  1. Um ensaio de ponto final , no qual uma única medição é realizada após um período de incubação fixo; ou
  2. Um ensaio cinético , no qual as medições são realizadas várias vezes em um intervalo de tempo fixo. Os resultados do ensaio cinético podem ser visualizados numericamente (por exemplo, como um parâmetro de inclinação que representa a taxa de mudança do sinal ao longo do tempo) ou graficamente (por exemplo, como um gráfico do sinal medido em cada ponto de tempo). Para ensaios cinéticos, a magnitude e a forma da resposta medida ao longo do tempo fornecem informações importantes.
  3. Um ensaio de alto rendimento pode ser um ponto final ou um ensaio cinético geralmente feito em uma plataforma automatizada em formatos de microplacas de 96, 384 ou 1536 poços ( triagem de alto rendimento ). Tais ensaios são capazes de testar um grande número de compostos ou analitos ou fazer leituras biológicas funcionais em resposta a um estímulo e / ou compostos sendo testados.

Número de analitos detectados

Dependendo de quantos alvos ou analitos estão sendo medidos:

  1. Os ensaios usuais são ensaios simples ou de alvo único, que geralmente é o padrão, a menos que seja chamado de multiplex.
  2. Os ensaios multiplex são usados ​​para medir simultaneamente a presença, concentração, atividade ou qualidade de vários analitos em um único teste. O advento da multiplexação possibilitou o teste rápido e eficiente de amostras em muitos campos, incluindo imunologia, citoquímica, genética / genômica, farmacocinética e toxicologia.

Tipo de resultado

Dependendo da qualidade do resultado produzido, os ensaios podem ser classificados em:

  1. Ensaios qualitativos , ou seja, ensaios que geralmente dão apenas uma aprovação ou reprovação, ou positivo ou negativo ou algum tipo de apenas um pequeno número de gradação qualitativa em vez de uma quantidade exata.
  2. Ensaios semiquantitativos , ou seja, ensaios que fornecem a leitura de uma forma aproximada em vez de um número exato para a quantidade da substância. Geralmente, eles têm algumas gradações a mais do que apenas dois resultados, positivos ou negativos, por exemplo, pontuação em uma escala de 1+ a 4+, conforme usado para testes de agrupamento sanguíneo com base na aglutinação de hemácias em resposta a reagentes de agrupamento (anticorpo contra antígenos de grupos sanguíneos).
  3. Ensaios quantitativos , ou seja, ensaios que fornecem medidas quantitativas numéricas precisas e exatas da quantidade de uma substância em uma amostra. Um exemplo de tal ensaio usado em laboratórios de teste de coagulação para a doença hemorrágica hereditária mais comum - a doença de Von Willebrand é o ensaio do antígeno VWF, onde a quantidade de VWF presente em uma amostra de sangue é medida por um imunoensaio.
  4. Ensaios funcionais , ou seja, um ensaio que tenta quantificar o funcionamento de uma substância ativa em vez de apenas sua quantidade. A contraparte funcional do ensaio de antígeno VWF é o ensaio de Cofator de Ristocetina , que mede a atividade funcional do VWF presente no plasma de um paciente adicionando plaquetas fixadas em formalina exógena e aumentando gradualmente as quantidades de medicamento denominado ristocetina enquanto mede a aglutinação das plaquetas fixas. Um ensaio semelhante, mas usado para um propósito diferente, é chamado de agregação plaquetária induzida pela ristocetina ou RIPA, que testa a resposta de plaquetas vivas endógenas de um paciente em resposta à ristocetina (exógena) e VWF (geralmente endógena).

Tipo e método de amostra

Dependendo do substrato geral no qual o princípio de ensaio é aplicado:

  1. Bioensaio : quando a resposta é a atividade biológica de objetos vivos. Exemplos incluem
    1. in vivo , organismo inteiro (por exemplo, camundongo ou outro sujeito injetado com uma droga)
    2. parte do corpo ex vivo (por exemplo, perna de um sapo)
    3. órgão ex vivo (por exemplo, coração de um cão)
    4. ex vivo parte de um órgão (por exemplo, um segmento de um intestino).
    5. tecido (por exemplo, lisado limulus)
    6. célula (por exemplo, plaquetas)
  2. Ensaio de ligação de ligante quando um ligante (geralmente uma molécula pequena) se liga a um receptor (geralmente uma proteína grande).
  3. Imunoensaio quando a resposta é uma reação do tipo de ligação ao antígeno-anticorpo.

Amplificação de sinal

Dependendo da natureza do sistema de amplificação de sinal, os ensaios podem ser de vários tipos, para citar alguns:

  1. Ensaio enzimático : as enzimas podem ser testadas por sua atividade altamente repetitiva em um grande número de substratos quando a perda de um substrato ou a fabricação de um produto pode ter um atributo mensurável como cor ou absorbância em um comprimento de onda ou luz particular ou eletroquimioluminescência ou elétrica / redox atividade.
  2. Sistemas de detecção de luz que podem usar amplificação, por exemplo, por um fotodiodo ou um tubo fotomultiplicador ou um dispositivo acoplado de carga resfriada .
  3. Substratos marcados com radioisótopos usados ​​em radioimunoensaios e ensaios de diálise de equilíbrio e podem ser detectados pela amplificação em contadores gama ou placas de raios-X , ou phosphorimager
  4. Ensaios de reação em cadeia da polimerase que amplificam um alvo de DNA (ou RNA) em vez do sinal
  5. Métodos de combinação Os ensaios podem utilizar uma combinação dos métodos acima e outros métodos de amplificação para melhorar a sensibilidade. por exemplo , imunoensaio enzimático ou EIA, ensaio imunoenzimático .

Método ou tecnologia de detecção

Dependendo da natureza dos ensaios do sistema de detecção podem ser baseados em:

  1. Formação de colônias ou contagem virtual de colônias : por exemplo, pela multiplicação de bactérias ou células em proliferação.
  2. Fotometria / espectrofotometria Quando a absorbância de um comprimento de onda específico de luz ao passar por um comprimento de percurso fixo através de uma cubeta de amostra de teste líquida é medida e a absorbância é comparada com um branco e padrões com quantidades graduadas do composto alvo. Se a luz emitida for de um comprimento de onda visível específico, pode ser chamada de colorimetria ou pode envolver comprimento de onda específico de luz, por exemplo, pelo uso de laser e emissão desinais fluorescentes de outro comprimento de onda específico que é detectado por meio de filtros ópticos de comprimento de onda muito específico.
  3. A transmitância da luz pode ser usada para medir, por exemplo, a eliminação da opacidade de um líquido criado por partículas suspensas devido à diminuição do número de grumos durante umareação de aglutinação de plaquetas.
  4. Turbidimetria quando a opacidade da luz transmitida diretamente que passa por uma amostra líquida é medida por detectores colocados diretamente na fonte de luz.
  5. Nefelometria onde uma medida da quantidade de dispersão de luz que ocorre quando um feixe de luz é passado através da solução é usada para determinar o tamanho e / ou concentração e / ou distribuição de tamanho das partículas na amostra.
  6. Reflectometria Quando a cor da luz refletida de uma amostra (geralmente seca) ou reagente é avaliada, por exemplo, as leituras automatizadas dos testes de tira reagente de urina.
  7. Medições viscoelásticas, por exemplo, viscometria, elastografia (por exemplo, tromboelastografia )
  8. Ensaios de contagem: por exemplo, célula de citometria de fluxo ótica ou contadores de partículas, ou contadores de células com base no princípio de coulter / impedância
  9. Ensaios de imagem, que envolvem análise de imagem manualmente ou por software:
    1. Citometria : quando a estatística do tamanho das células é avaliada por um processador de imagem.
  10. A detecção elétrica, por exemplo, envolvendo amperometria , voltametria , coulometria pode ser usada direta ou indiretamente para muitos tipos de medições quantitativas.
  11. Outros ensaios baseados em propriedades físicas podem usar
    1. Osmômetro
    2. Viscosímetro
    3. Eletrodos Ion Selective
    4. Teste sindrômico

Tipos de ensaio com base nos alvos sendo medidos

DNA

Os ensaios para estudar as interações de proteínas com DNA incluem:

Proteína

RNA

Ensaios de contagem, viabilidade, proliferação ou citotoxicidade de células

Um ensaio de contagem de células pode determinar o número de células vivas, o número de células mortas ou a proporção de um tipo de célula para outro, como numerar e digitar o vermelho em relação aos diferentes tipos de glóbulos brancos . Isso é medido por diferentes métodos físicos (transmissão de luz, mudança de corrente elétrica). Mas outros métodos usam a estrutura celular de sondagem bioquímica ou fisiologia (manchas). Outra aplicação é monitorar cultura de células ( ensaios de proliferação celular ou citotoxicidade ). Um ensaio de citotoxicidade mede o quão tóxico um composto químico é para as células .

Contaminantes ambientais ou alimentares

Surfactantes

Outros ensaios de células

Muitos ensaios de células foram desenvolvidos para avaliar parâmetros específicos ou resposta de células ( biomarcadores , fisiologia celular ). As técnicas usadas para estudar células incluem:

Ensaio de metástase

Petroquímica

Virologia

O ensaio de título viral baseado em HPCE usa um sistema proprietário de eletroforese capilar de alto desempenho para determinar o título de baculovírus .

O ensaio Trofile é usado para determinar o tropismo do HIV .

O ensaio da placa viral consiste em calcular o número de vírus presentes em uma amostra. Nesta técnica, o número de placas virais formadas por um inóculo viral é contado, a partir do qual a concentração real do vírus pode ser determinada.

Secreções celulares

Uma ampla gama de secreções celulares (digamos, um anticorpo específico ou citocina ) pode ser detectada usando a técnica ELISA . O número de células que secretam essas substâncias particulares pode ser determinado usando uma técnica relacionada, o ensaio ELISPOT .

Drogas

Qualidade

Quando vários ensaios medem o mesmo alvo, seus resultados e utilidade podem ou não ser comparáveis, dependendo da natureza do ensaio e de sua metodologia, confiabilidade, etc. Essas comparações são possíveis através do estudo de atributos gerais de qualidade dos ensaios, por exemplo, princípios de medição (incluindo identificação, amplificação e detecção), faixa dinâmica de detecção (geralmente a faixa de linearidade da curva padrão ), sensibilidade analítica , sensibilidade funcional , especificidade analítica , valores preditivos positivos , negativos , tempo de retorno, ou seja, tempo necessário para terminar um ciclo inteiro as etapas pré-analíticas até o final da última etapa pós-analítica (envio / transmissão do relatório), rendimento , ou seja, número de ensaios realizados por unidade de tempo (geralmente expresso como por hora), etc. Organizações ou laboratórios que realizam ensaios para fins profissionais, por exemplo, diagnóstico médico e prognósticos, análises ambientais, procedimentos forenses, pesquisa e desenvolvimento farmacêutico devem ser resolvidos rgo procedimentos de garantia de qualidade bem regulamentados , incluindo validação de método , calibração regular , controle de qualidade analítico , teste de proficiência , acreditação de teste , licenciamento de teste e deve documentar as certificações adequadas dos órgãos reguladores relevantes, a fim de estabelecer a confiabilidade de seus ensaios, especialmente para permanecer legalmente aceitável e responsável pela qualidade dos resultados do ensaio e também para convencer os clientes a usar seu ensaio comercial / profissionalmente.

Lista de bancos de dados BioAssay

Bancos de dados de bioatividade

Bancos de dados de bioatividade correlacionam estruturas ou outras informações químicas com resultados de bioatividade obtidos de bioensaios na literatura, patentes e programas de triagem.

Nome Desenvolvedor (s) lançamento inicial
ScrubChem Jason Bret Harris 2016
PubChem-BioAssay NIH  2004
ChEMBL EMBL-EBI 2009

Bancos de dados de protocolo

Bancos de dados de protocolo correlacionam resultados de bioensaios a seus metadados sobre condições experimentais e projetos de protocolo.

Nome Desenvolvedor (s) lançamento inicial
BioMetaData ou BioAssay Express Descoberta Colaborativa de Drogas 2016
PubChem-BioAssay NIH  2004

Veja também

Referências

links externos

  • Blair, Andrew Alexander (1911). "Ensaio"  . Em Chisholm, Hugh (ed.). Encyclopædia Britannica . 2 (11ª ed.). Cambridge University Press. pp. 776–778. Isso inclui uma explicação técnica detalhada das técnicas contemporâneas de ensaio de minério metálico.
  • A definição do dicionário de ensaio no Wikcionário