Biossensor - Biosensor

Um biossensor é um dispositivo analítico, utilizado para a detecção de uma substância química, que combina um componente biológico com um detector físico - químico . O elemento biológico sensível , por exemplo, tecido, microrganismos, organelas , receptores celulares , enzimas , anticorpos , ácidos nucléicos , etc., é um material derivado biologicamente ou componente biomimético que interage com, se liga ou reconhece o analito em estudo. Os elementos biologicamente sensíveis também podem ser criados por engenharia biológica . O transdutor ou elemento detector , que transforma um sinal em outro, atua de forma físico-química: óptica, piezoelétrica , eletroquímica, eletroquimioluminescência etc., resultante da interação do analito com o elemento biológico, para fácil medição e quantificação. O dispositivo leitor do biossensor se conecta aos componentes eletrônicos associados ou aos processadores de sinal que são os principais responsáveis ​​pela exibição dos resultados de uma maneira amigável. Isso às vezes é responsável pela parte mais cara do dispositivo sensor, no entanto, é possível gerar uma exibição amigável que inclui transdutor e elemento sensível ( sensor holográfico ). Os leitores são geralmente projetados e fabricados de acordo com os diferentes princípios de funcionamento dos biossensores.

Sistema biossensor

Um biossensor normalmente consiste em um bio-receptor (enzima / anticorpo / célula / ácido nucleico / aptâmero), componente transdutor (material semicondutor / nanomaterial) e sistema eletrônico que inclui um amplificador de sinal , processador e display. Transdutores e eletrônicos podem ser combinados, por exemplo, em sistemas de microssensores baseados em CMOS . O componente de reconhecimento, frequentemente chamado de bioreceptor, usa biomoléculas de organismos ou receptores modelados a partir de sistemas biológicos para interagir com o analito de interesse. Esta interação é medida pelo biotransdutor que emite um sinal mensurável proporcional à presença do analito alvo na amostra. O objetivo geral do projeto de um biossensor é permitir um teste rápido e conveniente no ponto de preocupação ou cuidado onde a amostra foi adquirida.

Bioreceptores

Biossensores usados ​​para triagem de bibliotecas combinatórias de DNA

Em um biossensor, o bioreceptor é projetado para interagir com o analito específico de interesse para produzir um efeito mensurável pelo transdutor. Alta seletividade para o analito entre uma matriz de outros componentes químicos ou biológicos é um requisito chave do bioreceptor. Embora o tipo de biomolécula usada possa variar amplamente, os biossensores podem ser classificados de acordo com tipos comuns de interações bioreceptoras envolvendo: anticorpo / antígeno, enzimas / ligantes, ácidos nucleicos / DNA, estruturas / células celulares ou materiais biomiméticos.

Interações anticorpo / antígeno

Um imunossensor utiliza a afinidade de ligação muito específica de anticorpos para um composto ou antígeno específico . A natureza específica da interação anticorpo-antígeno é análoga a um ajuste de fechadura e chave, pois o antígeno só se ligará ao anticorpo se ele tiver a conformação correta. Os eventos de ligação resultam em uma alteração físico-química que, em combinação com um traçador, como moléculas fluorescentes, enzimas ou radioisótopos, pode gerar um sinal. Existem limitações com o uso de anticorpos em sensores: 1. A capacidade de ligação do anticorpo é fortemente dependente das condições do ensaio (por exemplo, pH e temperatura), e 2. a interação anticorpo-antígeno é geralmente robusta, no entanto, a ligação pode ser interrompida por reagentes caotrópicos , solventes orgânicos, ou mesmo radiação ultrassônica.

As interações anticorpo-antígeno também podem ser usadas para testes sorológicos ou para a detecção de anticorpos circulantes em resposta a uma doença específica. É importante ressaltar que os testes de sorologia se tornaram uma parte importante da resposta global à pandemia COVID-19 .

Proteínas de ligação artificial

O uso de anticorpos como o componente de bio-reconhecimento de biossensores tem várias desvantagens. Eles têm pesos moleculares elevados e estabilidade limitada, contêm ligações dissulfeto essenciais e são caros de produzir. Em uma abordagem para superar essas limitações, fragmentos de ligação recombinantes ( Fab , Fv ou scFv ) ou domínios (VH, VHH ) de anticorpos foram projetados. Em outra abordagem, pequenos andaimes de proteínas com propriedades biofísicas favoráveis ​​foram projetados para gerar famílias artificiais de proteínas de ligação a antígenos (AgBP), capazes de ligação específica a diferentes proteínas alvo, enquanto retêm as propriedades favoráveis ​​da molécula parental. Os elementos da família que se ligam especificamente a um determinado antígeno alvo, são frequentemente selecionados in vitro por técnicas de exibição: exibição de fago , exibição de ribossomo , exibição de levedura ou exibição de mRNA . As proteínas de ligação artificiais são muito menores que os anticorpos (geralmente menos de 100 resíduos de aminoácidos), têm uma forte estabilidade, não têm ligações dissulfeto e podem ser expressas em alto rendimento em ambientes celulares redutores como o citoplasma bacteriano, ao contrário dos anticorpos e seus derivados . Eles são, portanto, especialmente adequados para criar biossensores.

Interações enzimáticas

As capacidades de ligação específicas e a atividade catalítica das enzimas as tornam bioreceptores populares. O reconhecimento do analito é habilitado através de vários mecanismos possíveis: 1) a enzima que converte o analito em um produto que é detectável por sensor, 2) detecta a inibição ou ativação da enzima pelo analito, ou 3) monitorando a modificação das propriedades da enzima resultante da interação com o analito . As principais razões para o uso comum de enzimas em biossensores são: 1) capacidade de catalisar um grande número de reações; 2) potencial para detectar um grupo de analitos (substratos, produtos, inibidores e moduladores da atividade catalítica); e 3) adequação com vários métodos de transdução diferentes para detectar o analito. Notavelmente, uma vez que as enzimas não são consumidas nas reações, o biossensor pode ser facilmente usado continuamente. A atividade catalítica das enzimas também permite limites de detecção mais baixos em comparação com as técnicas de ligação comuns. No entanto, a vida útil do sensor é limitada pela estabilidade da enzima.

Receptores de ligação de afinidade

Os anticorpos têm uma alta constante de ligação em excesso de 10 ^ 8 L / mol, que representa uma associação quase irreversível, uma vez que o par antígeno-anticorpo se formou. Para certas moléculas de analito, como proteínas de ligação por afinidade à glicose , existem que se ligam ao seu ligante com alta especificidade, como um anticorpo, mas com uma constante de ligação muito menor da ordem de 10 ^ 2 a 10 ^ 4 L / mol. A associação entre analito e receptor é então de natureza reversível e próximo ao casal entre ambos também ocorrem suas moléculas livres em uma concentração mensurável. No caso da glicose, por exemplo, a concanavalina A pode funcionar como receptor de afinidade exibindo uma constante de ligação de 4x10 ^ 2 L / mol. O uso de receptores de ligação de afinidade para fins de biossensorio foi proposto por Schultz e Sims em 1979 e foi subsequentemente configurado em um ensaio fluorescente para medir a glicose na faixa fisiológica relevante entre 4,4 e 6,1 mmol / L. O princípio do sensor tem a vantagem de não consumir o analito em uma reação química como ocorre nos ensaios enzimáticos.

Interações de ácido nucléico

Biossensores que empregam receptores baseados em ácido nucleico podem ser baseados em interações de emparelhamento de bases complementares referidas como genossensores ou imitadores de anticorpos baseados em ácidos nucleicos específicos (aptâmeros) como aptasensores. No primeiro caso, o processo de reconhecimento é baseado no princípio do emparelhamento de bases complementares , adenina: timina e citosina: guanina no DNA . Se a sequência de ácido nucleico alvo for conhecida, as sequências complementares podem ser sintetizadas, marcadas e então imobilizadas no sensor. O evento de hibridização pode ser detectado opticamente e a presença de DNA / RNA alvo verificada. No último, aptâmeros gerados contra o alvo o reconhecem por meio da interação de interações não covalentes específicas e ajuste induzido. Estes aptâmeros podem ser marcados com um fluoróforo / nanopartículas de metal facilmente para detecção óptica ou podem ser empregados para plataformas de detecção eletroquímica ou baseada em cantilever sem marcação para uma ampla gama de moléculas alvo ou alvos complexos como células e vírus. Além disso, aptâmeros podem ser combinados com enzimas de ácido nucleico, como DNAzimas de clivagem de RNA, fornecendo reconhecimento de alvo e geração de sinal em uma única molécula, o que mostra aplicações potenciais no desenvolvimento de biossensores multiplex.

Epigenética

Foi proposto que ressonadores ópticos integrados adequadamente otimizados podem ser explorados para detectar modificações epigenéticas (por exemplo, metilação do DNA, modificações pós-translacionais de histonas) em fluidos corporais de pacientes afetados por câncer ou outras doenças. Biossensores fotônicos com ultra-sensibilidade estão sendo desenvolvidos atualmente em nível de pesquisa para detectar facilmente células cancerosas na urina do paciente. Diferentes projetos de pesquisa têm como objetivo desenvolver novos dispositivos portáteis que utilizem cartuchos descartáveis ​​baratos e ecologicamente corretos, que requerem apenas um manuseio simples, sem necessidade de processamento, lavagem ou manipulação por técnicos especializados.

Organelas

Organelas formam compartimentos separados dentro das células e geralmente desempenham funções de forma independente. Diferentes tipos de organelas têm várias vias metabólicas e contêm enzimas para cumprir sua função. Organelas comumente usadas incluem lisossoma, cloroplasto e mitocôndria. O padrão de distribuição espaço-temporal do cálcio está intimamente relacionado à via de sinalização ubíqua. As mitocôndrias participam ativamente do metabolismo dos íons de cálcio para controlar a função e também modular as vias de sinalização relacionadas ao cálcio. Experimentos provaram que as mitocôndrias têm a capacidade de responder a altas concentrações de cálcio geradas em sua proximidade, abrindo os canais de cálcio. Desta forma, as mitocôndrias podem ser utilizadas para detectar a concentração de cálcio no meio e a detecção é muito sensível devido à alta resolução espacial. Outra aplicação de mitocôndrias é usada para detecção de poluição da água. A toxicidade dos compostos detergentes danificará a célula e a estrutura subcelular, incluindo as mitocôndrias. Os detergentes causarão um efeito de inchaço que pode ser medido por uma mudança de absorbância. Os dados da experiência mostram que a taxa de alteração é proporcional à concentração do detergente, fornecendo um alto padrão de precisão de detecção.

Células

As células são frequentemente usadas em bioreceptores porque são sensíveis ao ambiente circundante e podem responder a todos os tipos de estimulantes. As células tendem a se prender à superfície para que possam ser facilmente imobilizadas. Comparados às organelas, eles permanecem ativos por mais tempo e a reprodutibilidade os torna reutilizáveis. Eles são comumente usados ​​para detectar parâmetros globais como condição de estresse, toxicidade e derivados orgânicos. Eles também podem ser usados ​​para monitorar o efeito do tratamento de drogas. Uma aplicação é usar células para determinar os herbicidas que são o principal contaminante aquático. As microalgas são aprisionadas em uma microfibra de quartzo e a fluorescência da clorofila modificada por herbicidas é coletada na ponta de um feixe de fibra óptica e transmitida a um fluorímetro. As algas são continuamente cultivadas para obter uma medição otimizada. Os resultados mostram que o limite de detecção de certo herbicida pode atingir o nível de concentração sub-ppb. Algumas células também podem ser usadas para monitorar a corrosão microbiana. Pseudomonas sp. é isolado da superfície do material corroído e imobilizado na membrana de acetilcelulose. A atividade respiratória é determinada medindo o consumo de oxigênio. Existe uma relação linear entre a corrente gerada e a concentração de ácido sulfúrico. O tempo de resposta está relacionado ao carregamento das células e ambientes circundantes e pode ser controlado para não mais que 5min.

Tecido

Os tecidos são usados ​​como biossensores para a abundância de enzimas existentes. As vantagens dos tecidos como biossensores incluem o seguinte:

• mais fácil de imobilizar em comparação com células e organelas
• a maior atividade e estabilidade da manutenção de enzimas no ambiente natural
• a disponibilidade e baixo preço
• evitar o trabalho tedioso de extração, centrifugação e purificação de enzimas
• existem cofatores necessários para uma enzima funcionar
• a diversidade proporcionando um amplo leque de escolhas em relação a diferentes objetivos.

Também existem algumas desvantagens dos tecidos, como a falta de especificidade devido à interferência de outras enzimas e maior tempo de resposta devido à barreira de transporte.

Biossensores microbianos

Os biossensores microbianos exploram a resposta das bactérias a uma determinada substância. Por exemplo, o arsênio pode ser detectado usando o operon ars encontrado em vários táxons bacterianos.

Fixação superficial dos elementos biológicos

Detectando exossomos carregados negativamente vinculam uma superfície de grafeno

Uma parte importante de um biossensor é anexar os elementos biológicos (pequenas moléculas / proteínas / células) à superfície do sensor (seja metal, polímero ou vidro). A forma mais simples é funcionalizar a superfície para revesti-la com os elementos biológicos. Isso pode ser feito por polilisina, aminossilano, epoxissilano ou nitrocelulose no caso de chips de silício / vidro de sílica. Subsequentemente, o agente biológico ligado também pode ser fixado - por exemplo, por deposição camada por camada de revestimentos de polímero carregados alternativamente.

Alternativamente, reticulados tridimensionais ( hidrogel / xerogel ) podem ser usados ​​para aprisioná-los química ou fisicamente (em que aprisionado quimicamente significa que o elemento biológico é mantido no lugar por uma ligação forte, enquanto fisicamente eles são mantidos no lugar sendo incapazes de passar pelos poros da matriz de gel). O hidrogel mais comumente usado é o sol-gel , sílica vítrea gerada pela polimerização de monômeros de silicato (adicionados como tetra alquil ortossilicatos, como TMOS ou TEOS ) na presença de elementos biológicos (junto com outros polímeros estabilizadores, como PEG ) em o caso de aprisionamento físico.

Outro grupo de hidrogéis, que endurece em condições adequadas para células ou proteínas, são hidrogel de acrilato , que polimeriza após a iniciação do radical . Um tipo de iniciador de radical é um radical peróxido , normalmente gerado pela combinação de um persulfato com TEMED ( gel de poliacrilamida também é comumente usado para eletroforese de proteínas ), alternativamente, a luz pode ser usada em combinação com um fotoiniciador, como DMPA ( 2,2-dimetoxi -2-fenilacetofenona ). Materiais inteligentes que imitam os componentes biológicos de um sensor também podem ser classificados como biossensores usando apenas o sítio ativo ou catalítico ou configurações análogas de uma biomolécula.

Biotransdutor

Classificação de biossensores com base no tipo de biotransdutor

Os biossensores podem ser classificados por seu tipo de biotransdutor . Os tipos mais comuns de biotransdutores usados ​​em biossensores são:

• biossensores eletroquímicos
• biossensores ópticos
• biossensores eletrônicos
• biossensores piezoelétricos
• biossensores gravimétricos
• biossensores piroelétricos
• biossensores magnéticos

Eletroquímica

Os biossensores eletroquímicos são normalmente baseados na catálise enzimática de uma reação que produz ou consome elétrons (essas enzimas são corretamente chamadas de enzimas redox). O substrato do sensor geralmente contém três eletrodos ; um eletrodo de referência , um eletrodo de trabalho e um contra eletrodo. O analito alvo está envolvido na reação que ocorre na superfície do eletrodo ativo, e a reação pode causar transferência de elétrons através da camada dupla (produzindo uma corrente) ou pode contribuir para o potencial de camada dupla (produzindo uma voltagem). Podemos medir a corrente (a taxa de fluxo de elétrons agora é proporcional à concentração do analito) em um potencial fixo ou o potencial pode ser medido em corrente zero (isso dá uma resposta logarítmica). Observe que o potencial do eletrodo de trabalho ou ativo é sensível à carga espacial e é frequentemente usado. Além disso, a detecção elétrica direta e livre de marcadores de pequenos peptídeos e proteínas é possível por suas cargas intrínsecas usando transistores de efeito de campo sensíveis a íons biofuncionalizados .

Outro exemplo, o biossensor potenciométrico (potencial produzido na corrente zero) dá uma resposta logarítmica com uma alta faixa dinâmica. Esses biossensores são frequentemente feitos imprimindo os padrões do eletrodo em um substrato de plástico, revestido com um polímero condutor e, em seguida, alguma proteína (enzima ou anticorpo) é anexada. Eles têm apenas dois eletrodos e são extremamente sensíveis e robustos. Eles permitem a detecção de analitos em níveis anteriormente alcançáveis ​​apenas por HPLC e LC / MS e sem preparação de amostra rigorosa. Todos os biossensores geralmente envolvem uma preparação mínima de amostra, pois o componente de detecção biológica é altamente seletivo para o analito em questão. O sinal é produzido por mudanças eletroquímicas e físicas na camada de polímero condutor devido às mudanças que ocorrem na superfície do sensor. Tais mudanças podem ser atribuídas à força iônica, pH, hidratação e reações redox, esta última devido ao rótulo da enzima virando um substrato. Os transistores de efeito de campo, nos quais a região da porta foi modificada com uma enzima ou anticorpo, também podem detectar concentrações muito baixas de vários analitos, pois a ligação do analito à região da porta do FET causa uma mudança na corrente dreno-fonte.

O desenvolvimento de biossensores com base na espectroscopia de impedância tem ganhado força atualmente e muitos desses dispositivos / desenvolvimentos são encontrados na academia e na indústria. Um desses dispositivos, baseado em uma célula eletroquímica de 4 eletrodos, usando uma membrana de alumina nanoporosa, demonstrou detectar baixas concentrações de alfa-trombina humana na presença de alto fundo de albumina sérica. Também eletrodos interdigitados têm sido usados ​​para biossensores de impedância.

Troca de canal de íon

ICS - canal aberto

ICS - canal fechado

O uso de canais iônicos foi mostrado para oferecer detecção altamente sensível de moléculas biológicas alvo. Ao incorporar os canais de íons em membranas de bicamada suportadas ou amarradas (t-BLM) anexadas a um eletrodo de ouro, um circuito elétrico é criado. Moléculas de captura, como anticorpos, podem ser ligadas ao canal de íons de modo que a ligação da molécula alvo controle o fluxo de íons através do canal. Isso resulta em uma mudança mensurável na condução elétrica que é proporcional à concentração do alvo.

Um biossensor de troca de canal iônico (ICS) pode ser criado usando gramicidina, um canal de peptídeo dimérico, em uma membrana de bicamada amarrada. Um peptídeo de gramicidina, com anticorpo anexado, é móvel e outro é fixo. A quebra do dímero interrompe a corrente iônica através da membrana. A magnitude da mudança no sinal elétrico é grandemente aumentada separando a membrana da superfície do metal usando um espaçador hidrofílico.

A detecção quantitativa de uma extensa classe de espécies-alvo, incluindo proteínas, bactérias, drogas e toxinas foi demonstrada usando diferentes membranas e configurações de captura. O projeto de pesquisa europeu Greensense desenvolve um biossensor para realizar a triagem quantitativa de drogas de abuso, como THC, morfina e cocaína na saliva e na urina.

Biossensor fluorescente sem reagente

Um biossensor sem reagente pode monitorar um analito alvo em uma mistura biológica complexa sem reagente adicional. Portanto, pode funcionar continuamente se imobilizado em um suporte sólido. Um biossensor fluorescente reage à interação com seu analito alvo por uma mudança em suas propriedades de fluorescência. Um biossensor fluorescente sem reagente (biossensor de RF) pode ser obtido integrando um receptor biológico, que é direcionado contra o analito alvo, e um fluoróforo solvatocrômico, cujas propriedades de emissão são sensíveis à natureza de seu ambiente local, em uma única macromolécula. O fluoróforo transduz o evento de reconhecimento em um sinal óptico mensurável. O uso de fluoróforos extrínsecos, cujas propriedades de emissão diferem amplamente daquelas dos fluoróforos intrínsecos de proteínas, triptofano e tirosina, permite detectar e quantificar imediatamente o analito em misturas biológicas complexas. A integração do fluoróforo deve ser feita em um local onde seja sensível à ligação do analito sem perturbar a afinidade do receptor.

Anticorpos e famílias artificiais de proteínas de ligação a antígenos (AgBP) são bem adequados para fornecer o módulo de reconhecimento de biossensores de RF, uma vez que podem ser direcionados contra qualquer antígeno (consulte o parágrafo sobre bioreceptores). Uma abordagem geral para integrar um fluoróforo solvatocrômico em um AgBP quando a estrutura atômica do complexo com seu antígeno é conhecida e, assim, transformá-lo em um biossensor de RF, foi descrita. Um resíduo do AgBP é identificado na vizinhança do antígeno em seu complexo. Este resíduo é transformado em uma cisteína por mutagênese dirigida ao local. O fluoróforo é quimicamente acoplado à cisteína mutante. Quando o projeto é bem-sucedido, o fluoróforo acoplado não impede a ligação do antígeno, esta ligação protege o fluoróforo do solvente e pode ser detectado por uma mudança de fluorescência. Essa estratégia também é válida para fragmentos de anticorpos.

No entanto, na ausência de dados estruturais específicos, outras estratégias devem ser aplicadas. Anticorpos e famílias artificiais de AgBPs são constituídos por um conjunto de posições de resíduos hipervariáveis ​​(ou randomizadas), localizadas em uma única sub-região da proteína, e suportadas por uma estrutura polipeptídica constante. Os resíduos que formam o local de ligação para um determinado antígeno são selecionados entre os resíduos hipervariáveis. É possível transformar qualquer AgBP dessas famílias em um biossensor de RF, específico do antígeno alvo, simplesmente acoplando um fluoróforo solvatocrômico a um dos resíduos hipervariáveis ​​que têm pouca ou nenhuma importância para a interação com o antígeno, após a alteração deste resíduo. em cisteína por mutagênese. Mais especificamente, a estratégia consiste em alterar individualmente os resíduos das posições hipervariáveis ​​em cisteína no nível genético, em acoplar quimicamente um fluoróforo solvatocrômico com a cisteína mutante e, em seguida, manter os conjugados resultantes que têm a maior sensibilidade (um parâmetro que envolve afinidade e variação do sinal de fluorescência). Esta abordagem também é válida para famílias de fragmentos de anticorpos.

Estudos a posteriori mostraram que os melhores biossensores fluorescentes sem reagente são obtidos quando o fluoróforo não faz interações não covalentes com a superfície do bioreceptor, o que aumentaria o sinal de fundo, e quando ele interage com uma bolsa de ligação na superfície do antígeno alvo. Os biossensores de RF obtidos pelos métodos acima podem funcionar e detectar analitos alvo dentro de células vivas.

Biossensores magnéticos

Os biossensores magnéticos utilizam partículas paramagnéticas ou supra-paramagnéticas, ou cristais, para detectar interações biológicas. Os exemplos podem ser indutância de bobina, resistência ou outras propriedades magnéticas. É comum usar nano ou micropartículas magnéticas. Na superfície de tais partículas estão os bioreceptores, que podem ser anticorpos de DNA (complementar a uma sequência ou aptâmeros), ou outros. A ligação do bioreceptor afetará algumas das propriedades das partículas magnéticas que podem ser medidas por suscetometria AC, um sensor de efeito Hall, um dispositivo de magnetorresistência gigante ou outros.

Outros

Os sensores piezoelétricos utilizam cristais que sofrem uma deformação elástica quando um potencial elétrico é aplicado a eles. Um potencial alternado (CA) produz uma onda estacionária no cristal em uma frequência característica. Esta frequência é altamente dependente das propriedades elásticas do cristal, de modo que se um cristal for revestido com um elemento de reconhecimento biológico, a ligação de um analito alvo (grande) a um receptor irá produzir uma mudança na frequência de ressonância, o que dá uma ligação sinal. Em um modo que usa ondas acústicas de superfície (SAW), a sensibilidade é bastante aumentada. Esta é uma aplicação especializada da microbalança de cristal de quartzo como um biossensor

A eletroquimioluminescência (ECL) é hoje uma técnica líder em biossensores. Uma vez que as espécies excitadas são produzidas com um estímulo eletroquímico em vez de uma fonte de excitação de luz, o ECL exibe uma relação sinal-ruído melhorada em comparação com a fotoluminescência, com efeitos minimizados devido ao espalhamento de luz e fundo de luminescência. Em particular, o co-reagente ECL operando em solução aquosa tamponada na região de potenciais positivos (mecanismo de redução oxidativa) impulsionou definitivamente ECL para imunoensaio, conforme confirmado por muitas aplicações de pesquisa e, ainda mais, pela presença de importantes empresas que desenvolveram hardware comercial para análise de imunoensaios de alto rendimento em um mercado que vale bilhões de dólares a cada ano.

Biossensores termométricos são raros.

Biossensor MOSFET (BioFET)

O MOSFET (transistor de efeito de campo semicondutor de óxido metálico ou transistor MOS) foi inventado por Mohamed M. Atalla e Dawon Kahng em 1959 e demonstrado em 1960. Dois anos depois, Leland C. Clark e Champ Lyons inventaram o primeiro biossensor em 1962. Biossensores MOSFETs (BioFETs) foram desenvolvidos posteriormente e, desde então, têm sido amplamente usados ​​para medir parâmetros físicos , químicos , biológicos e ambientais .

O primeiro BioFET foi o transistor de efeito de campo sensível a íons (ISFET), inventado por Piet Bergveld para aplicações eletroquímicas e biológicas em 1970. o FET de adsorção (ADFET) foi patenteado por PF Cox em 1974, e um MOSFET sensível ao hidrogênio foi demonstrado por I. Lundstrom, MS Shivaraman, CS Svenson e L. Lundkvist em 1975. O ISFET é um tipo especial de MOSFET com um portão a uma certa distância, e onde o portão de metal é substituído por uma membrana sensível a íons , solução eletrolítica e eletrodo de referência . O ISFET é amplamente utilizado em aplicações biomédicas , como detecção de hibridização de DNA , detecção de biomarcadores de sangue , detecção de anticorpos , medição de glicose , detecção de pH e tecnologia genética .

Em meados da década de 1980, outros BioFETs foram desenvolvidos, incluindo o sensor de gás FET (GASFET), sensor de pressão FET (PRESSFET), transistor de efeito de campo químico (ChemFET), referência ISFET (REFET), FET modificado por enzima (ENFET) e FET modificado imunologicamente (IMFET). No início dos anos 2000, os BioFETs, como o transistor de efeito de campo do DNA (DNAFET), o FET modificado por gene (GenFET) e o BioFET de potencial celular (CPFET), foram desenvolvidos.

Colocação de biossensores

O posicionamento adequado dos biossensores depende de seu campo de aplicação, que pode ser dividido em biotecnologia , agricultura , tecnologia de alimentos e biomedicina .

Em biotecnologia, a análise da composição química do caldo de cultivo pode ser realizada in-line, on-line, at-line e off-line. Conforme descrito pela Food and Drug Administration ( FDA ) dos EUA, a amostra não é removida do fluxo do processo para sensores em linha, mas é desviada do processo de fabricação para medições online. Para sensores at-line, a amostra pode ser removida e analisada em estreita proximidade com o fluxo do processo. Um exemplo deste último é o monitoramento da lactose em uma planta de processamento de laticínios. Os biossensores off-line são comparados às técnicas bioanalíticas que não operam no campo, mas no laboratório. Essas técnicas são utilizadas principalmente na agricultura, tecnologia de alimentos e biomedicina.

Em aplicações médicas, os biossensores são geralmente classificados como sistemas in vitro e in vivo . Uma medição de biossensor in vitro ocorre em um tubo de ensaio, uma placa de cultura, uma placa de microtitulação ou em outro lugar fora de um organismo vivo. O sensor usa um bioreceptor e transdutor conforme descrito acima. Um exemplo de biossensor in vitro é um biossensor enzimático para monitoramento de glicose no sangue . Existe o desafio de criar um biossensor que opere pelo princípio do teste no local de atendimento , ou seja, no local onde o teste é necessário. O desenvolvimento de biossensores vestíveis está entre esses estudos. A eliminação dos testes de laboratório pode economizar tempo e dinheiro. Uma aplicação de um biossensor POCT pode ser para o teste de HIV em áreas onde é difícil para os pacientes serem testados. Um biossensor pode ser enviado diretamente para o local e um teste rápido e fácil pode ser usado.

Implante de biossensor para monitoramento de glicose no tecido subcutâneo (59x45x8 mm). Os componentes eletrônicos são hermeticamente fechados em um invólucro de Ti, enquanto a antena e a sonda do sensor são moldadas no cabeçalho de epóxi.

Um biossensor in vivo é um dispositivo implantável que opera dentro do corpo. Obviamente, os implantes de biossensores devem cumprir os regulamentos estritos sobre esterilização , a fim de evitar uma resposta inflamatória inicial após o implante. A segunda preocupação diz respeito à biocompatibilidade de longo prazo , ou seja, a interação não prejudicial com o ambiente corporal durante o período de uso pretendido. Outro problema que surge é o fracasso. Se houver falha, o dispositivo deve ser removido e substituído, causando cirurgia adicional. Um exemplo de aplicação de um biossensor in vivo seria o monitoramento da insulina dentro do corpo, que ainda não está disponível.

Os implantes de biossensores mais avançados foram desenvolvidos para o monitoramento contínuo de glicose. A figura exibe um dispositivo, para o qual são usados um invólucro de Ti e uma bateria, conforme estabelecido para implantes cardiovasculares, como marca - passos e desfibriladores . Seu tamanho é determinado pela bateria, conforme necessário para a vida útil de um ano. Os dados de glicose medidos serão transmitidos sem fio para fora do corpo dentro da banda MICS 402-405 MHz conforme aprovado para implantes médicos.

Os biossensores também podem ser integrados em sistemas de telefonia móvel, tornando-os fáceis de usar e acessíveis a um grande número de usuários.

Formulários

Biosenseamento do vírus da gripe usando um diamante dopado com boro modificado com anticorpo

Existem muitas aplicações potenciais de biossensores de vários tipos. Os principais requisitos para uma abordagem de biossensor ser valiosa em termos de pesquisa e aplicações comerciais são a identificação de uma molécula alvo, a disponibilidade de um elemento de reconhecimento biológico adequado e o potencial de sistemas de detecção portáteis descartáveis ​​a serem preferidos a técnicas sensíveis baseadas em laboratório em algumas situações. Alguns exemplos são o monitoramento da glicose em pacientes com diabetes, outros alvos relacionados à saúde médica, aplicações ambientais, por exemplo, a detecção de pesticidas e contaminantes da água do rio, como íons de metais pesados, sensoriamento remoto de bactérias transportadas pelo ar , por exemplo, em atividades de contra-bioterrorismo, sensoriamento remoto de qualidade da água nas águas costeiras, descrevendo online diferentes aspectos da etologia dos moluscos (ritmos biológicos, taxas de crescimento, desova ou registros de morte) em grupos de bivalves abandonados em todo o mundo, detecção de patógenos, determinação dos níveis de substâncias tóxicas antes e após a biorremediação , detecção e determinação de organofosforados , medição analítica de rotina de ácido fólico , biotina , vitamina B12 e ácido pantotênico como alternativa ao ensaio microbiológico , determinação de resíduos de drogas em alimentos, como antibióticos e promotores de crescimento , particularmente carne e mel, descoberta de drogas e avaliação de biológicos atividade de novos compostos, engenharia de proteínas em biossensores s, e detecção de metabólitos tóxicos, como micotoxinas .

Um exemplo comum de biossensor comercial é o biossensor de glicose no sangue , que usa a enzima glicose oxidase para quebrar a glicose no sangue. Ao fazer isso, primeiro oxida a glicose e usa dois elétrons para reduzir o FAD (um componente da enzima) a FADH2. Este, por sua vez, é oxidado pelo eletrodo em várias etapas. A corrente resultante é uma medida da concentração de glicose. Nesse caso, o eletrodo é o transdutor e a enzima é o componente biologicamente ativo.

Um canário em uma gaiola , usado pelos mineiros para alertar sobre o gás, pode ser considerado um biossensor. Muitas das aplicações atuais de biossensores são semelhantes, no sentido de que eles usam organismos que respondem a substâncias tóxicas em concentrações muito mais baixas do que os humanos podem detectar para alertar sobre sua presença. Esses dispositivos podem ser usados ​​em monitoramento ambiental, detecção de gases traço e em instalações de tratamento de água.

Muitos biossensores ópticos são baseados no fenômeno de técnicas de ressonância de plasmon de superfície (SPR). Isso utiliza uma propriedade de e outros materiais; especificamente que uma fina camada de ouro em uma superfície de vidro de alto índice de refração pode absorver a luz do laser, produzindo ondas de elétrons (plasmons de superfície) na superfície do ouro. Isso ocorre apenas em um ângulo e comprimento de onda específicos da luz incidente e é altamente dependente da superfície do ouro, de modo que a ligação de um analito alvo a um receptor na superfície do ouro produz um sinal mensurável.

Os sensores de ressonância de plasma de superfície operam usando um chip sensor que consiste em um cassete de plástico que suporta uma placa de vidro, com um lado revestido com uma camada microscópica de ouro. Este lado entra em contato com o aparelho de detecção óptica do instrumento. O lado oposto é então contatado com um sistema de fluxo microfluídico. O contato com o sistema de fluxo cria canais através dos quais os reagentes podem ser passados ​​na solução. Este lado do chip sensor de vidro pode ser modificado de várias maneiras, para permitir a fácil fixação das moléculas de interesse. Normalmente é revestido com carboximetil dextrano ou composto semelhante.

O índice de refração no lado do fluxo da superfície do chip tem uma influência direta no comportamento da luz refletida no lado dourado. A ligação ao lado do fluxo do chip tem um efeito no índice de refração e, dessa forma, as interações biológicas podem ser medidas em um alto grau de sensibilidade com algum tipo de energia. O índice de refração do meio próximo à superfície muda quando as biomoléculas se fixam na superfície, e o ângulo SPR varia em função dessa mudança.

A luz de um comprimento de onda fixo é refletida no lado dourado do chip no ângulo de reflexão interna total e detectada dentro do instrumento. O ângulo da luz incidente é variado de modo a corresponder à taxa de propagação da onda evanescente com a taxa de propagação dos polaritons do plasmon de superfície. Isso induz a onda evanescente a penetrar através da placa de vidro e a alguma distância no líquido que flui sobre a superfície.

Outros biossensores ópticos são baseados principalmente em mudanças na absorbância ou fluorescência de um composto indicador apropriado e não precisam de uma geometria de reflexão interna total. Por exemplo, um dispositivo de protótipo totalmente operacional que detecta caseína no leite foi fabricado. O dispositivo é baseado na detecção de mudanças na absorção de uma camada de ouro. Uma ferramenta de pesquisa amplamente utilizada, o micro-array, também pode ser considerado um biossensor.

Os biossensores biológicos geralmente incorporam uma forma geneticamente modificada de uma proteína ou enzima nativa. A proteína é configurada para detectar um analito específico e o sinal resultante é lido por um instrumento de detecção, como um fluorômetro ou luminômetro. Um exemplo de biossensor desenvolvido recentemente é aquele para detectar a concentração citosólica do analito cAMP (adenosina monofosfato cíclico), um segundo mensageiro envolvido na sinalização celular desencadeada por ligantes interagindo com receptores na membrana celular. Sistemas semelhantes foram criados para estudar as respostas celulares a ligantes nativos ou xenobióticos (toxinas ou inibidores de pequenas moléculas). Esses "ensaios" são comumente usados ​​no desenvolvimento de descoberta de medicamentos por empresas farmacêuticas e de biotecnologia. A maioria dos ensaios de cAMP em uso atual requerem lise das células antes da medição de cAMP. Um biossensor de células vivas para cAMP pode ser usado em células não lisadas com a vantagem adicional de múltiplas leituras para estudar a cinética da resposta do receptor.

Os nanobiossensores usam uma sonda bioreceptor imobilizada que é seletiva para moléculas de analito alvo. Os nanomateriais são sensores químicos e biológicos extremamente sensíveis. Os materiais em nanoescala demonstram propriedades únicas. Sua grande área de superfície para relação de volume pode gerar reações rápidas e de baixo custo, usando uma variedade de designs.

Outros biossensores de ondas evanescentes têm sido comercializados usando guias de ondas onde a constante de propagação através do guia de ondas é alterada pela absorção de moléculas na superfície do guia de ondas. Um exemplo, a interferometria de polarização dupla usa um guia de ondas enterrado como uma referência contra a qual a mudança na constante de propagação é medida. Outras configurações, como Mach – Zehnder, têm braços de referência definidos litograficamente em um substrato. Níveis mais altos de integração podem ser alcançados usando geometrias de ressonador, onde a frequência ressonante de um ressonador de anel muda quando as moléculas são absorvidas.

Recentemente, arranjos de muitas moléculas de detectores diferentes foram aplicados nos chamados dispositivos eletrônicos de nariz , onde o padrão de resposta dos detectores é usado para imprimir as impressões digitais de uma substância. No detector de odores Wasp Hound , o elemento mecânico é uma câmera de vídeo e o elemento biológico são cinco vespas parasitas que foram condicionadas a enxamear em resposta à presença de um produto químico específico. Os narizes eletrônicos comerciais atuais, entretanto, não usam elementos biológicos.

Monitoramento de glicose

Os monitores de glicose comercialmente disponíveis baseiam-se na detecção amperométrica da glicose por meio da glicose oxidase , que oxida a glicose produzindo peróxido de hidrogênio, que é detectado pelo eletrodo. Para superar a limitação dos sensores amperométricos, uma enxurrada de pesquisas está presente em novos métodos de detecção, como biossensores fluorescentes de glicose .

Sensor de imagem de refletância interferométrica

O sensor de imagem de refletância interferométrica (IRIS) é baseado nos princípios de interferência óptica e consiste em um substrato de óxido de silício-silício, óptica padrão e LEDs coerentes de baixa potência. Quando a luz é iluminada através de uma objetiva de baixa ampliação no substrato de óxido de silício em camadas, uma assinatura interferométrica é produzida. Como a biomassa, que possui um índice de refração semelhante ao do óxido de silício, se acumula na superfície do substrato, ocorre uma alteração na assinatura interferométrica e a alteração pode ser correlacionada a uma massa quantificável. Daaboul et al. usou IRIS para produzir uma sensibilidade livre de rótulo de aproximadamente 19 ng / mL. Ahn et al. melhorou a sensibilidade do IRIS por meio de uma técnica de marcação em massa.

Desde a publicação inicial, o IRIS foi adaptado para desempenhar várias funções. Em primeiro lugar, o IRIS integrou uma capacidade de imagem de fluorescência no instrumento de imagem interferométrica como uma forma potencial de abordar a variabilidade de microarray de proteína de fluorescência. Resumidamente, a variação em microarranjos de fluorescência deriva principalmente da imobilização inconsistente de proteínas em superfícies e pode causar diagnósticos incorretos em microarranjos de alergia. Para corrigir qualquer variação na imobilização da proteína, os dados adquiridos na modalidade de fluorescência são então normalizados pelos dados adquiridos na modalidade sem etiqueta. O IRIS também foi adaptado para realizar a contagem de nanopartículas simples, simplesmente mudando a objetiva de baixa ampliação usada para quantificação de biomassa sem rótulo para uma ampliação de objetiva maior. Esta modalidade permite a discriminação de tamanho em amostras biológicas humanas complexas. Monroe et al. usou IRIS para quantificar os níveis de proteína adicionados ao sangue total humano e ao soro e determinou a sensibilização ao alérgeno em amostras de sangue humano caracterizadas usando processamento de amostra zero. Outros usos práticos deste dispositivo incluem detecção de vírus e patógenos.

Análise de alimentos

Existem várias aplicações de biossensores na análise de alimentos. Na indústria de alimentos, as ópticas revestidas com anticorpos são comumente usadas para detectar patógenos e toxinas alimentares. Comumente, o sistema de luz nesses biossensores é a fluorescência, uma vez que esse tipo de medição óptica pode amplificar muito o sinal.

Uma gama de ensaios de ligação imunológica e ligante para a detecção e medição de pequenas moléculas, como vitaminas solúveis em água e contaminantes químicos ( resíduos de drogas ), como sulfonamidas e beta-agonistas , foram desenvolvidos para uso em sistemas de sensores baseados em SPR , muitas vezes adaptado de ELISA existente ou outro ensaio imunológico. Estes são amplamente utilizados na indústria de alimentos.

Biossensores de DNA

O DNA pode ser o analito de um biossensor, sendo detectado por meios específicos, mas também pode ser utilizado como parte de um biossensor ou, teoricamente, até mesmo como um biossensor completo.

Existem muitas técnicas para detectar DNA, que geralmente é um meio de detectar organismos que possuem esse DNA específico. As sequências de DNA também podem ser utilizadas como descrito acima. Mas existem abordagens mais progressistas, nas quais o DNA pode ser sintetizado para conter enzimas em um gel biológico estável. Outras aplicações são o projeto de aptâmeros, sequências de DNA que têm uma forma específica para se ligar a uma molécula desejada. Os processos mais inovadores usam origami de DNA para isso, criando sequências que se dobram em uma estrutura previsível que é útil para detecção.

Biossensores de ozônio

Como o ozônio filtra a radiação ultravioleta prejudicial, a descoberta de buracos na camada de ozônio da atmosfera terrestre levantou preocupações sobre a quantidade de luz ultravioleta que atinge a superfície terrestre. De particular preocupação são as questões de quão profundamente a radiação ultravioleta penetra na água do mar e como ela afeta os organismos marinhos , especialmente o plâncton (microorganismos flutuantes) e os vírus que atacam o plâncton. O plâncton forma a base das cadeias alimentares marinhas e acredita-se que afete a temperatura e o clima do nosso planeta pela absorção de CO 2 para a fotossíntese.

Deneb Karentz, pesquisador do Laboratório de Radio-biologia e Saúde Ambiental ( University of California, San Francisco ), desenvolveu um método simples para medir a penetração ultravioleta e a intensidade. Trabalhando no oceano Antártico, ela submergiu em várias profundidades finas sacolas plásticas contendo cepas especiais de E. coli que são quase totalmente incapazes de reparar os danos da radiação ultravioleta em seu DNA. As taxas de mortalidade bacteriana nessas bolsas foram comparadas com as taxas em bolsas de controle não expostas do mesmo organismo. Os "biossensores" bacterianos revelaram danos ultravioleta significativos e constantes a profundidades de 10 me frequentemente a 20 e 30 m. Karentz planeja estudos adicionais de como o ultravioleta pode afetar o florescimento sazonal de plâncton (surtos de crescimento) nos oceanos.

Biossensores de células cancerosas metastáticas

A metástase é a propagação do câncer de uma parte do corpo para outra por meio do sistema circulatório ou do sistema linfático. Ao contrário dos exames de imagem radiológica (mamografias), que enviam formas de energia (raios-x, campos magnéticos, etc.) através do corpo para apenas tirar fotos do interior, os biossensores têm o potencial de testar diretamente o poder maligno do tumor. A combinação de um elemento biológico e detector permite uma pequena necessidade de amostra, um design compacto, sinais rápidos, detecção rápida, alta seletividade e alta sensibilidade para o analito em estudo. Em comparação com os testes de imagem radiológica usuais, os biossensores têm a vantagem de não apenas descobrir até que ponto o câncer se espalhou e verificar se o tratamento é eficaz, mas também são maneiras mais baratas e eficientes (em tempo, custo e produtividade) de avaliar a metastaticidade nos estágios iniciais de Câncer.

Pesquisadores de engenharia biológica criaram biossensores oncológicos para câncer de mama. O câncer de mama é o principal câncer comum entre as mulheres em todo o mundo. Um exemplo seria uma microbalança de cristal de quartzo de transferrina (QCM). Como um biossensor, as microbalanças de cristal de quartzo produzem oscilações na frequência da onda estacionária do cristal a partir de um potencial alternado para detectar mudanças na massa de nanogramas. Esses biossensores são projetados especificamente para interagir e ter alta seletividade para receptores em superfícies celulares (cancerosas e normais). Idealmente, isso fornece uma detecção quantitativa de células com este receptor por área de superfície, em vez de uma detecção de imagem qualitativa dada por mamografias.

Seda Atay, pesquisadora de biotecnologia da Hacettepe University, observou experimentalmente essa especificidade e seletividade entre células mamárias QCM e MDA-MB 231 , células MCF 7 e células MDA-MB 231 famintas in vitro. Com outros pesquisadores, ela desenvolveu um método de lavar essas diferentes células metastáticas niveladas sobre os sensores para medir as mudanças de massa devido a diferentes quantidades de receptores de transferrina. Particularmente, o poder metastático das células do câncer de mama pode ser determinado por microbalanças de cristal de quartzo com nanopartículas e transferrina que potencialmente se ligariam aos receptores de transferrina nas superfícies das células cancerosas. Há uma seletividade muito alta para os receptores de transferrina porque eles são superexpressos nas células cancerosas. Se as células têm alta expressão de receptores de transferrina, o que mostra seu alto poder metastático, elas têm maior afinidade e se ligam mais ao QCM que mede o aumento de massa. Dependendo da magnitude da mudança de massa do nanograma, a potência metastática pode ser determinada.

Além disso, nos últimos anos, importantes atenções têm sido voltadas para detectar os biomarcadores do câncer de pulmão sem biópsia. Nesse sentido, os biossensores são ferramentas muito atraentes e aplicáveis ​​para fornecer detecções rápidas, sensíveis, específicas, estáveis, econômicas e não invasivas para o diagnóstico precoce do câncer de pulmão. Assim, biossensores de câncer consistem em moléculas de biorreconhecimento específicas, como anticorpos, sondas de ácido nucleico complementares ou outras biomoléculas imobilizadas em uma superfície de transdutor. As moléculas de biorreconhecimento interagem especificamente com os biomarcadores (alvos) e as respostas biológicas geradas são convertidas pelo transdutor em um sinal analítico mensurável. Dependendo do tipo de resposta biológica, vários transdutores são utilizados na fabricação de biossensores de câncer, como transdutores eletroquímicos, ópticos e baseados em massa.

Detecção de patógenos

Biossensores incorporados para assinaturas patogênicas - como SARS-CoV-2 - que podem ser vestidas foram desenvolvidos - como máscaras faciais com testes incorporados .

Veja também

Referências

Bibliografia

• Frieder Scheller e Florian Schubert (1989). Biosensoren . Akademie-Verlag, Berlin. ISBN 978-3-05-500659-3.
• Massimo Grattarola e Giuseppe Massobrio (1998). Bioelectronics Handbook - MOSFETs, Biosensors and Neurons . McGraw-Hill, Nova York. ISBN 978-0070031746.

links externos

• O que são biossensores
• Arranhando a superfície dos biossensores - um Instant Insight discutindo como a química da superfície permite que os biossensores de silício poroso cumpram sua promessa da Royal Society of Chemistry