CCR5 - CCR5

CCR5
CCR5 + membrana1.png
Estruturas disponíveis
PDB Pesquisa Ortholog: PDBe RCSB
Identificadores
Apelido CCR5 , CC-CKR-5, CCCKR5, CCR-5, CD195, CKR-5, CKR5, CMKBR5, IDDM22, receptor 5 de quimiocina com motivo CC (gene / pseudogene), receptor 5 de quimiocina com motivo CC
IDs externos OMIM : 601373 MGI : 107182 HomoloGene : 37325 GeneCards : CCR5
Ortólogos
Espécies Humano Mouse
Entrez
Conjunto
UniProt
RefSeq (mRNA)

NM_001100168
NM_000579
NM_001394783

NM_009917

RefSeq (proteína)

NP_000570
NP_001093638

NP_034047

Localização (UCSC) Chr 3: 46,37 - 46,38 Mb Chr 9: 124,12 - 124,15 Mb
Pesquisa PubMed
Wikidata
Ver / Editar Humano Ver / Editar Mouse
Ligação do HIV a uma célula T auxiliar CD4 +: 1) a proteína viral gp120 se liga ao CD4. 2) o loop variável gp120 se conecta a um co-receptor, seja CCR5 ou CXCR4. 3) O HIV entra na célula.

O receptor de quimiocina CC tipo 5 , também conhecido como CCR5 ou CD195 , é uma proteína na superfície das células brancas do sangue que está envolvida no sistema imunológico , pois atua como um receptor para quimiocinas .

Em humanos, o gene CCR5 que codifica a proteína CCR5 está localizado no braço curto (p) na posição 21 no cromossomo 3 . Certas populações herdaram a mutação Delta 32 , resultando na deleção genética de uma parte do gene CCR5. Os portadores homozigotos dessa mutação são resistentes às cepas M-trópicas da infecção pelo HIV-1 .

Função

A proteína CCR5 pertence à família de receptores de quimiocinas beta de proteínas integrais de membrana . É um receptor acoplado à proteína G que funciona como um receptor de quimiocinas no grupo das quimiocinas CC .

Os ligantes cognatos de CCR5 incluem CCL3 , CCL4 (também conhecido como MIP 1 α e 1 β , respectivamente) e CCL3L1 . Além disso, o CCR5 interage com o CCL5 (uma proteína citocina quimiotática também conhecida como RANTES).

O CCR5 é predominantemente expresso em células T , macrófagos , células dendríticas , eosinófilos , microglia e uma subpopulação de células de câncer de mama ou de próstata. A expressão de CCR5 é induzida seletivamente durante o processo de transformação do câncer e não é expressa em células epiteliais normais da mama ou da próstata. Aproximadamente 50% do câncer de mama humano expressou CCR5, principalmente no câncer de mama triplo negativo. Os inibidores de CCR5 bloquearam a migração e metástase de células de câncer de mama e próstata que expressavam CCR5, sugerindo que CCR5 pode funcionar como um novo alvo terapêutico. Estudos recentes sugerem que o CCR5 é expresso em um subconjunto de células cancerosas com características de células-tronco cancerosas, que são conhecidas por impulsionar a resistência à terapia, e que os inibidores de CCR5 aumentam o número de células mortas pela quimioterapia atual. É provável que o CCR5 desempenhe um papel nas respostas inflamatórias à infecção, embora seu papel exato na função imunológica normal não seja claro. As regiões desta proteína também são cruciais para a ligação do ligante de quimiocina, a resposta funcional do receptor e a atividade do co-receptor do HIV.

Sequência de proteína primária

HIV

O HIV-1 mais comumente usa os receptores de quimiocinas CCR5 e / ou CXCR4 como co-receptores para entrar nas células imunológicas alvo. Esses receptores estão localizados na superfície das células imunes do hospedeiro, pelo que fornecem um método de entrada para o vírus HIV-1 infectar a célula. A estrutura da glicoproteína do envelope do HIV-1 é essencial para permitir a entrada viral do HIV-1 em uma célula hospedeira alvo. A estrutura da glicoproteína do envelope consiste em duas subunidades proteicas clivadas de um precursor da proteína Gp160 codificado pelo gene env do HIV-1 : a subunidade externa Gp120 e a subunidade transmembrana Gp41. Esta estrutura de glicoproteína de envelope está disposta em uma estrutura semelhante a um pico localizada na superfície do vírion e consiste em um trímero de heterodímeros Gp120-Gp41. A proteína do envelope Gp120 é um mimetizador da quimiocina. Embora não tenha a estrutura única de uma quimiocina, ainda é capaz de se ligar aos receptores de quimiocina CCR5 e CXCR4. Durante a infecção pelo HIV-1, a subunidade da glicoproteína do envelope Gp120 liga-se a uma glicoproteína CD4 e a um co-receptor do HIV-1 expresso em uma célula-alvo, formando um complexo heterotrimérico. A formação desse complexo estimula a liberação de um peptídeo fusogênico, fazendo com que a membrana viral se funda com a membrana da célula hospedeira alvo. Uma vez que a ligação apenas ao CD4 pode às vezes resultar na liberação da gp120, a gp120 deve, em seguida, ligar-se ao co-receptor CCR5 para que a fusão prossiga. O terminal amino sulfatado com tirosina deste co-receptor é o "determinante essencial" da ligação à glicoproteína gp120. O co-receptor também reconhece a região V1-V2 de gp120 e a folha de ponte (uma folha β de 4 fitas antiparalela que conecta os domínios interno e externo de gp120). A haste V1-V2 pode influenciar "o uso do co-receptor por meio de sua composição de peptídeo, bem como pelo grau de glicosilação ligada a N." Ao contrário de V1-V2, no entanto, o loop V3 é altamente variável e, portanto, é o determinante mais importante da especificidade do co-receptor. Os ligantes normais para este receptor, RANTES , MIP-1β e MIP-1α , são capazes de suprimir a infecção por HIV-1 in vitro . Em indivíduos infectados com HIV, os vírus que usam CCR5 são as espécies predominantes isoladas durante os estágios iniciais da infecção viral, sugerindo que esses vírus podem ter uma vantagem seletiva durante a transmissão ou na fase aguda da doença. Além disso, pelo menos metade de todos os indivíduos infectados abrigam apenas vírus que usam CCR5 durante o curso da infecção.

O CCR5 é o co-receptor primário usado pela gp120 sequencialmente com o CD4. Esta ligação resulta em gp41, o outro produto de proteína de gp160, a ser liberado de sua conformação metaestável e se inserir na membrana da célula hospedeira. Embora não tenha sido confirmado, a ligação de gp120-CCR5 envolve duas etapas cruciais: 1) O terminal amino sulfatado com tirosina deste co-receptor é um "determinante essencial" da ligação a gp120 (como afirmado anteriormente) 2) Após a etapa 1 ., deve haver ação recíproca (sinergia, intercomunicação) entre gp120 e os domínios transmembranares CCR5.

O CCR5 é essencial para a disseminação da cepa R5 do vírus HIV-1. O conhecimento do mecanismo pelo qual esta cepa de HIV-1 medeia a infecção estimulou a pesquisa sobre o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para bloquear a função do CCR5. Uma série de novos medicamentos experimentais para o HIV, chamados antagonistas do receptor CCR5 , foram projetados para interferir na ligação entre a proteína do envelope Gp120 e o co-receptor CCR5 do HIV. Essas drogas experimentais incluem PRO140 ( CytoDyn ), Vicriviroc (ensaios de Fase III foram cancelados em julho de 2010) ( Schering Plough ), Aplaviroc (GW-873140) ( GlaxoSmithKline ) e Maraviroc (UK-427857) ( Pfizer ). O Maraviroc foi aprovado para uso pelo FDA em agosto de 2007. É o único até agora aprovado pelo FDA para uso clínico, tornando-se assim o primeiro inibidor do CCR5. Um problema dessa abordagem é que, embora o CCR5 seja o principal correceptor pelo qual o HIV infecta as células, ele não é o único correceptor. É possível que, sob pressão seletiva, o HIV evolua para usar outro co-receptor. No entanto, o exame de resistência viral a AD101, antagonista molecular de CCR5, indicou que os vírus resistentes não mudaram para outro co-receptor (CXCR4), mas persistiram no uso de CCR5: eles se ligaram a domínios alternativos de CCR5 ou ao receptor em um maior afinidade. No entanto, como ainda há outro co-receptor disponível, é provável que a falta do gene CCR5 não torne alguém imune ao vírus; seria simplesmente mais desafiador para o indivíduo contraí-lo. Além disso, o vírus ainda tem acesso ao CD4. Ao contrário do CCR5, que não é necessário (como evidenciado por aqueles que vivem vidas saudáveis ​​mesmo quando não têm o gene como resultado da mutação delta32), o CD4 é crítico no sistema de defesa imunológico do corpo. Mesmo sem a disponibilidade de qualquer um dos co-receptores (mesmo CCR5), o vírus ainda pode invadir células se gp41 passasse por uma alteração (incluindo sua cauda citoplasmática) que resultou na independência de CD4 sem a necessidade de CCR5 e / ou CXCR4 como uma porta.

Câncer

A expressão de CCR5 é induzida em células epiteliais da mama e da próstata após transformação. A indução da expressão de CCR5 promove invasão celular, migração e metástase. A indução de metástases envolve o direcionamento para o local metastático. Os inibidores de CCR5, incluindo maraviroc e leronlimab, mostraram bloquear a metástase pulmonar de linhas de células de câncer de mama humano. Em estudos pré-clínicos de camundongos imunocompetentes, os inibidores de CCR5 bloquearam a metástase para os ossos e o cérebro. Os inibidores de CCR5 também reduzem a infiltração de macrófagos associados a tumores. Um estudo clínico de Fase 1 de um inibidor de CCR5 em pacientes fortemente pré-tratados com câncer de cólon metastático demonstrou uma resposta clínica objetiva e redução na carga de tumor metastático.

Cérebro

Níveis aumentados de CCR5 são parte da resposta inflamatória ao acidente vascular cerebral. O bloqueio do CCR5 com Maraviroc (um medicamento aprovado para o HIV) pode aumentar a recuperação após o derrame.

No cérebro em desenvolvimento, quimiocinas como o CCR5 influenciam a migração e a conexão neuronal. Após o derrame, eles parecem diminuir o número de locais de conexão nos neurônios próximos ao dano.

CCR5-Δ32

CCR5-Δ32 (ou CCR5-D32 ou CCR5 delta 32) é um alelo de CCR5.

CCR5 Δ32 é uma deleção de 32 pares de bases que introduz um códon de parada prematura no locus do receptor CCR5, resultando em um receptor não funcional. O CCR5 é necessário para a entrada do vírus HIV-1 com trópico M. Indivíduos homozigotos (denotados Δ32 / Δ32) para CCR5 Δ32 não expressam receptores CCR5 funcionais em suas superfícies celulares e são resistentes à infecção por HIV-1 , apesar de múltiplas exposições de alto risco. Os indivíduos heterozigotos (+ / Δ32) para o alelo mutante têm uma redução superior a 50% nos receptores CCR5 funcionais em suas superfícies celulares devido à dimerização entre os receptores mutantes e de tipo selvagem que interfere no transporte do CCR5 para a superfície celular. Os portadores heterozigotos são resistentes à infecção por HIV-1 em relação aos tipos selvagens e, quando infectados, os heterozigotos exibem cargas virais reduzidas e uma progressão mais lenta de 2-3 anos para AIDS em relação aos tipos selvagens. A heterozigosidade para este alelo mutante também mostrou melhorar a resposta virológica ao tratamento anti-retroviral. CCR5 Δ32 tem uma frequência de alelo (heterozigoto) de 10% na Europa e uma frequência de homozigoto de 1%.

Pesquisas recentes indicam que CCR5 Δ32 melhora a cognição e a memória. Em 2016, os pesquisadores mostraram que a remoção do gene CCR5 de camundongos melhorou significativamente sua memória. O CCR5 é um poderoso supressor de plasticidade neuronal, aprendizagem e memória; A superativação de CCR5 por proteínas virais pode contribuir para déficits cognitivos associados ao HIV.

História evolutiva e idade do alelo

O alelo CCR5 Δ32 é notável por sua origem recente, frequência inesperadamente alta e distribuição geográfica distinta, que juntas sugerem que (a) ele surgiu de uma única mutação e (b) foi historicamente sujeito a seleção positiva.

Dois estudos usaram a análise de ligação para estimar a idade da deleção Δ32 do CCR5, assumindo que a quantidade de recombinação e mutação observada nas regiões genômicas ao redor da deleção Δ32 do CCR5 seria proporcional à idade da deleção. Usando uma amostra de 4.000 indivíduos de 38 populações étnicas, Stephens et al. estimou que a deleção CCR5-Δ32 ocorreu 700 anos atrás (275-1875, intervalo de confiança de 95%). Outro grupo, Libert et al. (1998) usaram mutações de microssatélites para estimar a idade da mutação CCR5 Δ32 em 2100 anos (700-4800, intervalo de confiança de 95%). Com base nos eventos de recombinação observados, eles estimaram a idade da mutação em 2.250 anos (900-4700, intervalo de confiança de 95%). Uma terceira hipótese baseia-se no gradiente norte-sul da frequência alélica na Europa, o que mostra que a frequência alélica mais alta ocorreu nos países nórdicos e a frequência alélica mais baixa no sul da Europa. Como os vikings ocuparam historicamente esses países, pode ser possível que o alelo se espalhou pela Europa devido à dispersão Viking nos séculos 8 a 10. Mais tarde, os vikings foram substituídos pelos varangianos na Rússia, o que pode ter contribuído para a observação do cline leste-oeste da frequência alélica.

O HIV-1 foi inicialmente transmitido de chimpanzés ( Pan troglodytes ) para humanos no início de 1900 no sudeste dos Camarões, na África, por meio da exposição a sangue infectado e fluidos corporais durante o abate de carne de caça. No entanto, o HIV-1 estava efetivamente ausente da Europa até a década de 1980. Portanto, dada a idade média de aproximadamente 1000 anos para o alelo CCR5-Δ32, pode-se estabelecer que o HIV-1 não exerceu pressão de seleção na população humana por tempo suficiente para atingir as frequências atuais. Assim, outros patógenos têm sido sugeridos como agentes de seleção positiva para CCR5 Δ32, incluindo a peste bubônica ( Yersinia pestis ) e a varíola ( Variola major ). Outros dados sugerem que a frequência do alelo experimentou pressão de seleção negativa como resultado de patógenos que se tornaram mais comuns durante a expansão romana. A ideia de que a seleção negativa desempenhou um papel na baixa frequência do alelo também é corroborada por experimentos com camundongos knockout e Influenza A, que demonstraram que a presença do receptor CCR5 é importante para uma resposta eficiente a um patógeno.

Evidência para uma única mutação

Várias linhas de evidência sugerem que o alelo CCR5 Δ32 evoluiu apenas uma vez. Primeiro, o CCR5 Δ32 tem uma frequência relativamente alta em várias populações europeias diferentes, mas está comparativamente ausente nas populações asiáticas, do Oriente Médio e dos índios americanos, sugerindo que uma única mutação ocorreu após a divergência de europeus de seu ancestral africano. Em segundo lugar, a análise de ligação genética indica que a mutação ocorre em um fundo genético homogêneo, o que implica que a herança da mutação ocorreu de um ancestral comum. Isso foi demonstrado mostrando que o alelo CCR5 Δ32 está em forte desequilíbrio de ligação com microssatélites altamente polimórficos. Mais de 95% dos cromossomos CCR5 Δ32 também carregavam o alelo IRI3.1-0, enquanto 88% carregavam o alelo IRI3.2. Em contraste, os marcadores microssatélites IRI3.1-0 e IRI3.2-0 foram encontrados em apenas 2 ou 1,5% dos cromossomos carregando um alelo CCR5 de tipo selvagem. Esta evidência de desequilíbrio de ligação apóia a hipótese de que a maioria, senão todos, os alelos CCR5 Δ32 surgiram de um único evento mutacional. Finalmente, o alelo CCR5 Δ32 tem uma distribuição geográfica única, indicando uma única origem do Norte seguida pela migração. Um estudo que mediu as frequências alélicas em 18 populações europeias encontrou um gradiente Norte-Sul, com as frequências alélicas mais altas nas populações finlandesa e Mordvinian (16%) e as mais baixas na Sardenha (4%).

Seleção positiva

Na ausência de seleção, uma única mutação levaria cerca de 127.500 anos para aumentar a uma frequência populacional de 10%. As estimativas baseadas nas taxas de recombinação genética e mutação situam a idade do alelo entre 1000 e 2000 anos. Essa discrepância é uma marca da seleção positiva.

Estima-se que o HIV-1 entrou na população humana na África no início de 1900; no entanto, infecções sintomáticas não foram relatadas até a década de 1980. A epidemia de HIV-1 é, portanto, muito jovem para ser a fonte de seleção positiva que levou a frequência de CCR5 Δ32 de zero a 10% em 2.000 anos. Stephens, et al. (1998), sugerem que a peste bubônica ( Yersinia pestis ) exerceu pressão seletiva positiva no CCR5 Δ32. Essa hipótese foi baseada no momento e na gravidade da pandemia da Peste Negra, que matou 30% da população europeia de todas as idades entre 1346 e 1352. Após a Peste Negra, ocorreram epidemias intermitentes menos graves. Cidades individuais experimentaram alta mortalidade, mas a mortalidade geral na Europa foi de apenas alguns por cento. Em 1655-1656, uma segunda pandemia chamada "Grande Peste" matou 15-20% da população da Europa. É importante ressaltar que as epidemias de peste foram intermitentes. A peste bubônica é uma doença zoonótica que infecta principalmente roedores, espalha-se por pulgas e, apenas ocasionalmente, infecta humanos. A infecção de peste bubônica entre humanos não ocorre, embora possa ocorrer na peste pneumônica, que infecta os pulmões. Somente quando a densidade de roedores é baixa, as pulgas infectadas são forçadas a se alimentar de hospedeiros alternativos, como humanos, e nessas circunstâncias pode ocorrer uma epidemia humana. Com base em modelos genéticos populacionais, Galvani e Slatkin (2003) argumentam que a natureza intermitente das epidemias de peste não gerou uma força seletiva suficientemente forte para conduzir a frequência alélica de CCR5 Δ32 a 10% na Europa.

Para testar essa hipótese, Galvani e Slatkin (2003) modelaram as pressões de seleção históricas produzidas pela peste e pela varíola. A peste foi modelada de acordo com relatos históricos, enquanto a mortalidade por varíola específica por idade foi obtida a partir da distribuição por idade dos cemitérios de varíola em York (Inglaterra) entre 1770 e 1812. A varíola infecta preferencialmente jovens membros pré-reprodutivos da população, uma vez que são os únicos indivíduos não imunizados ou mortos por infecções anteriores. Como a varíola mata preferencialmente os membros pré-reprodutivos de uma população, ela gera uma pressão seletiva mais forte do que a peste. Ao contrário da peste, a varíola não tem reservatório animal e só é transmitida de pessoa para pessoa. Os autores calcularam que se a peste fosse selecionada para CCR5 Δ32, a frequência do alelo ainda seria menor que 1%, enquanto a varíola exerceu uma força seletiva suficiente para chegar a 10%.

A hipótese de que a varíola exerceu seleção positiva para CCR5 Δ32 também é biologicamente plausível, uma vez que os poxvírus, como o HIV, entram nas células brancas do sangue usando receptores de quimiocinas. Em contraste, Yersinia pestis é uma bactéria com uma biologia muito diferente.

Embora os europeus sejam o único grupo a ter subpopulações com alta frequência de CCR5 Δ32, eles não são a única população sujeita à seleção pela varíola, que tinha uma distribuição mundial antes de ser declarada erradicada em 1980. As primeiras descrições inconfundíveis de a varíola apareceu no século 5 DC na China, no século 7 DC na Índia e no Mediterrâneo e no século 10 DC no sudoeste da Ásia. Em contraste, a mutação CCR5 Δ 32 é encontrada apenas nas populações da Europa, Ásia Ocidental e Norte da África. A frequência anormalmente alta de CCR5 Δ32 nessas populações parece exigir uma origem única no norte da Europa e a seleção subsequente por varíola.

Custos potenciais

O CCR5 Δ32 pode ser benéfico para o hospedeiro em algumas infecções (por exemplo, HIV-1, possivelmente varíola), mas prejudicial em outras (por exemplo, encefalite transmitida por carrapatos, vírus do Nilo Ocidental). Se a função do CCR5 é útil ou prejudicial no contexto de uma determinada infecção depende de uma interação complexa entre o sistema imunológico e o patógeno.

Em geral, a pesquisa sugere que a mutação CCR5 Δ32 pode desempenhar um papel deletério nos processos inflamatórios pós-infecção, que podem lesar o tecido e criar mais patologia. A melhor evidência para esta proposta de pleiotropia antagônica é encontrada nas infecções por flavivírus . Em geral, muitas infecções virais são assintomáticas ou produzem apenas sintomas leves na grande maioria da população. No entanto, certos indivíduos azarados experimentam um curso clínico particularmente destrutivo, que de outra forma não tem explicação, mas parece ser geneticamente mediado. Pacientes homozigotos para CCR5 Δ32 apresentaram maior risco de uma forma neuroinvasiva de encefalite transmitida por carrapatos (um flavivírus). Além disso, o CCR5 funcional pode ser necessário para prevenir a doença sintomática após a infecção com o vírus do Nilo Ocidental , outro flavivírus; CCR5 Δ32 foi associado ao desenvolvimento de sintomas iniciais e manifestações clínicas mais pronunciadas após a infecção pelo vírus do Nilo Ocidental.

Este achado em humanos confirmou um experimento previamente observado em um modelo animal de homozigosidade CCR5 Δ32. Após a infecção com o vírus do Nilo Ocidental, os camundongos CCR5 Δ32 aumentaram acentuadamente os títulos virais no sistema nervoso central e aumentaram a mortalidade em comparação com os camundongos do tipo selvagem, sugerindo assim que a expressão do CCR5 era necessária para montar uma forte defesa do hospedeiro contra o vírus do Nilo Ocidental .

Aplicações médicas

Uma abordagem genética envolvendo intracorpos que bloqueiam a expressão de CCR5 foi proposta como um tratamento para indivíduos infectados pelo HIV-1 . Quando as células T modificadas para que não expressem mais CCR5 foram misturadas com células T não modificadas que expressam CCR5 e, em seguida, desafiadas pela infecção com HIV-1, as células T modificadas que não expressam CCR5 eventualmente assumem a cultura, como HIV-1 mata as células T não modificadas. Este mesmo método pode ser usado in vivo para estabelecer um pool de células resistentes a vírus em indivíduos infectados.

Essa hipótese foi testada em um paciente com AIDS que também desenvolveu leucemia mielóide e foi tratado com quimioterapia para suprimir o câncer. Um transplante de medula óssea contendo células-tronco de um doador compatível foi então usado para restaurar o sistema imunológico. No entanto, o transplante foi realizado a partir de um doador com 2 cópias do gene da mutação CCR5-Δ32. Após 600 dias, o paciente estava saudável e apresentava níveis indetectáveis ​​de HIV no sangue e nos tecidos retais e cerebrais examinados. Antes do transplante, também foram detectados baixos níveis de HIV X4 , que não usa o receptor CCR5. Após o transplante, entretanto, esse tipo de HIV também não foi detectado. No entanto, este resultado é consistente com a observação de que as células que expressam a proteína variante CCR5-Δ32 não têm os receptores CCR5 e CXCR4 em suas superfícies, conferindo resistência a uma ampla gama de variantes do HIV, incluindo HIVX4. Depois de mais de seis anos, o paciente manteve a resistência ao HIV e foi declarado curado da infecção pelo HIV.

A inscrição de pacientes HIV-positivos em um ensaio clínico foi iniciado em 2009, no qual as células dos pacientes foram geneticamente modificadas com uma nuclease de dedo de zinco para transportar o traço CCR5-Δ32 e então reintroduzidas no corpo como um tratamento potencial para o HIV. Os resultados reportados em 2014 foram promissores.

Inspirado pela primeira pessoa a ser curada do HIV, The Berlin Patient , StemCyte iniciou colaborações com bancos de sangue do cordão em todo o mundo para rastrear sistematicamente amostras de sangue do cordão umbilical para a mutação CCR5 a partir de 2011.

Em novembro de 2018, Jiankui He anunciou que havia editado dois embriões humanos, para tentar desativar o gene para CCR5, que codifica um receptor que o HIV usa para entrar nas células. Ele disse que as meninas gêmeas, Lulu e Nana , nasceram algumas semanas antes, e que as meninas ainda carregavam cópias funcionais do CCR5 junto com o CCR5 deficiente ( mosaicismo ), portanto, ainda eram vulneráveis ​​ao HIV. O trabalho foi amplamente condenado como antiético, perigoso e prematuro.

Veja também

Referências

Leitura adicional

links externos