Centrifugação - Centrifugation

A centrifugação é um processo mecânico que envolve o uso da força centrífuga para separar as partículas de uma solução de acordo com seu tamanho, forma, densidade, viscosidade média e velocidade do rotor. Os componentes mais densos da mistura migram para longe do eixo da centrífuga , enquanto os componentes menos densos da mistura migram em direção ao eixo. Químicos e biólogos podem aumentar a força gravitacional efetiva do tubo de ensaio para que o precipitado (pellet) viaje rápida e totalmente para o fundo do tubo. O líquido restante que fica acima do precipitado é chamado de sobrenadante ou sobrenadante.

Existe uma correlação entre o tamanho e a densidade de uma partícula e a taxa com que a partícula se separa de uma mistura heterogênea, quando a única força aplicada é a da gravidade. Quanto maior o tamanho e a densidade das partículas, mais rápido elas se separam da mistura. Ao aplicar uma força gravitacional efetiva maior à mistura, como uma centrífuga, a separação das partículas é acelerada. Isso é ideal em ambientes industriais e de laboratório porque as partículas que se separariam naturalmente por um longo período de tempo podem ser separadas em muito menos tempo.

A taxa de centrifugação é especificada pela velocidade angular geralmente expressa como revoluções por minuto (RPM), ou aceleração expressa como g . O fator de conversão entre RPM eg depende do raio do rotor da centrífuga . A velocidade de sedimentação das partículas na centrifugação é uma função de seu tamanho e forma, aceleração centrífuga, fração de volume dos sólidos presentes, diferença de densidade entre a partícula e o líquido e a viscosidade . A aplicação mais comum é a separação de suspensões sólidas de altamente concentradas, que é usada no tratamento de lamas de esgoto para desidratação onde sedimentos menos consistentes são produzidos.

O método de centrifugação tem uma ampla variedade de aplicações industriais e laboratoriais; Esse processo não é apenas usado para separar duas substâncias miscíveis, mas também para analisar as propriedades hidrodinâmicas das macromoléculas. É um dos métodos de pesquisa mais importantes e comumente usados ​​em bioquímica , biologia celular e molecular . Nas indústrias química e alimentícia, as centrífugas especiais podem processar um fluxo contínuo de líquido carregado de partículas. A centrifugação também é o método mais comum usado para enriquecimento de urânio , contando com a ligeira diferença de massa entre os átomos de U-238 e U-235 no gás hexafluoreto de urânio .

Fórmula matemática

Em uma suspensão líquida, muitas partículas ou células cairão gradualmente para o fundo do recipiente devido à gravidade ; entretanto, o tempo gasto para tais separações não é viável. Outras partículas, que são muito pequenas, não podem ser isoladas em solução até que sejam expostas a uma alta força centrífuga . Como a suspensão é girada a uma determinada velocidade ou rotações por minuto (RPM), a força centrífuga permite que as partículas se desloquem radialmente para longe do eixo de rotação. A fórmula geral para calcular as revoluções por minuto (RPM) de uma centrífuga é:

,

onde g representa a força respectiva da centrífuga er o raio do centro do rotor até um ponto na amostra.

Porém, dependendo do modelo de centrífuga utilizado, o respectivo ângulo do rotor e o raio podem variar, portanto a fórmula é modificada. Por exemplo, o rotor Sorvall # SS-34 tem um raio máximo de 10,8 cm, então a fórmula se torna , o que pode ser simplificado ainda mais .

Quando comparada à gravidade, a força da partícula é chamada de 'Força Centrífuga Relativa' (RCF). É a força perpendicular exercida sobre o conteúdo do rotor como resultado da rotação, sempre em relação à gravidade da terra, que mede a resistência de rotores de diferentes tipos e tamanhos. Por exemplo, o RCF de 1000 xg significa que a força centrífuga é 1000 vezes mais forte do que a força gravitacional terrestre. O RCF depende da velocidade de rotação em rpm e da distância das partículas do centro de rotação. A fórmula mais comum usada para calcular o RCF é:

,

onde é uma constante; r é o raio, expresso em centímetros , entre o eixo de rotação e o centro; e rpm é a velocidade em rotações por minuto.

Historicamente, muitas separações foram realizadas na velocidade de 3000 rpm; um guia aproximado para a força 'g' exercida nesta velocidade é multiplicar o raio de centrifugação por um fator de 10, então um raio de 160 mm dá aproximadamente 1600 x g. Esta é uma abordagem bastante arbitrária, uma vez que o RCF aplicado é linearmente dependente do raio, então um raio 10% maior significa que um RCF 10% maior é aplicado na mesma velocidade. Grosso modo, a fórmula acima pode ser simplificada para , com um erro de apenas 0,62%.

Centrifugação em pesquisa biológica

Microcentrífugas

As microcentrífugas são modelos de mesa especialmente projetados com rotores leves e de pequeno volume, capazes de aceleração muito rápida até aproximadamente 17.000 rpm. Eles são dispositivos leves que são usados ​​principalmente para centrifugação de curta duração de amostras de até cerca de 0,2–2,0 mL. No entanto, devido à sua pequena escala, eles são facilmente transportáveis ​​e, se necessário, podem ser operados em uma sala fria. Eles podem ser refrigerados ou não. A microcentrífuga é normalmente usada em laboratórios de pesquisa onde pequenas amostras de moléculas biológicas, células ou núcleos devem ser submetidas a alto RCF por intervalos de tempo relativamente curtos. As microcentrífugas projetadas para operação em alta velocidade podem atingir até 35.000 rpm, dando RCF de até 30000 × ge são chamadas de microcentrífugas de alta velocidade.

Centrífugas de baixa velocidade

Centrífugas de baixa velocidade são usadas para coletar precipitados químicos, células intactas (animais, plantas e alguns microrganismos), núcleos, cloroplastos, grandes mitocôndrias e os fragmentos maiores da membrana plasmática. Gradientes de densidade para purificar células também são executados nessas centrífugas. Os rotores de caçamba giratória tendem a ser usados ​​amplamente devido à grande flexibilidade do tamanho da amostra por meio do uso de adaptadores. Essas máquinas têm velocidades máximas de rotor de menos de 10.000 rpm e variam de pequenas centrífugas de bancada a grandes centrífugas de chão.

Centrífugas de alta velocidade

Centrífugas de alta velocidade são normalmente usadas para coletar microrganismos, vírus , mitocôndrias , lisossomas , peroxissomos e membranas tubulares de Golgi intactas. A maioria das tarefas simples de peletização é realizada em rotores de ângulo fixo. Algum trabalho de gradiente de densidade para purificar células e organelas pode ser realizado em rotores de balde oscilante ou, no caso de gradientes de Percoll , em rotores de ângulo fixo. Centrífugas de alta velocidade ou supervelocidade podem lidar com volumes de amostra maiores, de algumas dezenas de mililitros a vários litros. Além disso, centrífugas maiores também podem atingir velocidades angulares mais altas (cerca de 30.000 rpm). Os rotores podem vir com adaptadores diferentes para acomodar vários tamanhos de tubos de ensaio , garrafas ou placas de microtitulação .

Ultracentrifugações

A ultracentrifugação faz uso de alta força centrífuga para estudar propriedades de partículas biológicas em velocidades excepcionalmente altas. As ultracentrífugas atuais podem girar até 150.000 rpm (equivalente a 1.000.000 xg). Eles são usados ​​para colher todas as vesículas de membrana derivadas da membrana plasmática, retículo endoplasmático (RE) e membrana de Golgi , endossomos , ribossomos , subunidades ribossômicas, plasmídeos , DNA , RNA e proteínas em rotores de ângulo fixo. Em comparação com microcentrífugas ou centrífugas de alta velocidade, ultracentrífugas podem isolar partículas muito menores e, além disso, enquanto microcentrífugas e supercentrífugas separam partículas em lotes (volumes limitados de amostras devem ser manuseados manualmente em tubos de ensaio ou garrafas), ultracentrífugas podem separar moléculas em lote ou sistemas de fluxo contínuo.

A ultracentrifugação é empregada para a separação de macromoléculas / estudos de cinética de ligação de ligante, separação de várias frações de lipoproteína do plasma e desprotonização de fluidos fisiológicos para análise de aminoácidos.

Eles são as centrífugas mais comumente usadas para a purificação de gradiente de densidade de todas as partículas, exceto células, e embora baldes oscilantes tenham sido tradicionalmente usados ​​para esta finalidade, rotores de ângulo fixo e rotores verticais também são usados, particularmente para gradientes autogerados e podem melhorar muito a eficiência da separação. Existem dois tipos de ultracentrífugas: a analítica e a preparativa.

Ultracentrifugação analítica

A ultracentrifugação analítica (AUC) pode ser usada para determinar as propriedades das macromoléculas, como forma, massa, composição e conformação. É uma técnica de análise biomolecular comumente usada para avaliar a pureza da amostra, para caracterizar os mecanismos de montagem e desmontagem de complexos biomoleculares , para determinar estequiometrias de subunidade , para identificar e caracterizar mudanças conformacionais macromoleculares e para calcular constantes de equilíbrio e parâmetros termodinâmicos para autoassociação e sistemas de heteroassociação. Ultracentrífugas analíticas incorporam um sistema de detecção óptica baseado em luz visível / ultravioleta para monitoramento em tempo real do progresso da amostra durante uma rotação.

As amostras são centrifugadas com uma solução de alta densidade, como sacarose , cloreto de césio ou iodixanol . A solução de alta densidade pode estar em uma concentração uniforme em todo o tubo de ensaio ("almofada") ou em uma concentração variável (" gradiente "). Propriedades moleculares pode ser modelado por meio de sedimentação análise de velocidade de sedimentação ou análise de equilíbrio. Durante a execução, a partícula ou moléculas migrarão através do tubo de ensaio em velocidades diferentes dependendo de suas propriedades físicas e das propriedades da solução e, eventualmente, formarão um pellet no fundo do tubo, ou bandas em várias alturas.

Ultracentrifugação preparativa

Ultracentrífugas preparativas são frequentemente utilizadas para separar partículas de acordo com suas densidades, isolar e / ou coletar partículas mais densas para coleta no pellet e clarificar suspensões contendo partículas. Às vezes, os pesquisadores também usam ultracentrífugas preparativas se precisarem de flexibilidade para alterar o tipo de rotor no instrumento. As ultracentrífugas preparativas podem ser equipadas com uma ampla gama de diferentes tipos de rotores, que podem girar amostras de diferentes números, em diferentes ângulos e em diferentes velocidades.

Processo de fracionamento

Na pesquisa biológica, o fracionamento celular normalmente inclui o isolamento de componentes celulares, mantendo as funções individuais de cada componente. Geralmente, a amostra de células é armazenada em uma suspensão que é:

  • Tamponado - pH neutro, evitando danos à estrutura das proteínas, incluindo enzimas (que podem afetar as ligações iônicas)
  • Isotônico (de potencial de água igual) - evita o ganho ou perda de água pelas organelas
  • Cool - reduzindo a atividade geral da enzima liberada posteriormente no procedimento

A centrifugação é a primeira etapa na maioria dos fracionamentos . Por meio de centrifugação em baixa velocidade, os resíduos celulares podem ser removidos, deixando um sobrenadante preservando o conteúdo da célula. A centrifugação repetida em velocidades progressivamente mais altas irá fracionar homogenatos de células em seus componentes. Em geral, quanto menor o componente subcelular, maior é a força centrífuga necessária para sedimentá-lo. A fração solúvel de qualquer lisado pode então ser separada em seus constituintes usando uma variedade de métodos.

Centrifugação diferencial

A centrifugação diferencial é o método mais simples de fracionamento por centrifugação, comumente usado para separar organelas e membranas encontradas nas células. As organelas geralmente diferem umas das outras em densidade e tamanho, tornando possível o uso de centrifugação diferencial e centrifugação em geral. As organelas podem então ser identificadas por meio de testes de indicadores que são exclusivos das organelas específicas. A aplicação mais amplamente usada desta técnica é a produção de frações subcelulares brutas de um homogenato de tecido, como o fígado de rato. Partículas de diferentes densidades ou tamanhos em uma suspensão são sedimentadas em taxas diferentes, com as partículas maiores e mais densas sedimentando mais rapidamente. Essas taxas de sedimentação podem ser aumentadas usando a força centrífuga.

Uma suspensão de células é submetida a uma série de ciclos crescentes de força centrífuga para produzir uma série de peletes compreendendo células com uma taxa de sedimentação decrescente. O homogenato inclui núcleos, mitocôndrias, lisossomas, peroxissomos, folhas de membrana plasmática e uma ampla gama de vesículas derivadas de vários compartimentos da membrana intracelular e também da membrana plasmática, tipicamente em um meio tamponado.

Centrifugação de gradiente de densidade

A centrifugação por gradiente de densidade é conhecida por ser um dos métodos mais eficientes para separar partículas suspensas e é usada tanto como uma técnica de separação quanto como um método para medir a densidade de partículas ou moléculas em uma mistura.

É usado para separar partículas com base no tamanho, forma e densidade, usando um meio de densidades graduadas. Durante uma centrifugação relativamente curta ou lenta, as partículas são separadas por tamanho, com as partículas maiores sedimentando mais longe do que as menores. Durante uma centrifugação longa ou rápida, as partículas viajam para locais no gradiente onde a densidade do meio é a mesma da densidade das partículas; (ρp - ρm) → 0. Portanto, uma partícula pequena e densa inicialmente sedimenta menos prontamente do que uma partícula grande de baixa densidade. As partículas grandes alcançam sua posição de densidade de equilíbrio mais cedo, enquanto as partículas pequenas migram lentamente através da zona de partículas grandes e, por fim, assumem uma posição de equilíbrio mais profunda no gradiente.

Um tubo, depois de centrifugado por esse método, apresenta partículas em ordem de densidade com base na altura. O objeto ou partícula de interesse residirá na posição dentro do tubo correspondente à sua densidade. No entanto, algumas sedimentações não ideais ainda são possíveis ao usar este método. O primeiro problema potencial é a agregação indesejada de partículas, mas isso pode ocorrer em qualquer centrifugação. A segunda possibilidade ocorre quando gotículas de solução que contêm partículas sedimentam. Isso é mais provável de ocorrer ao trabalhar com uma solução que tem uma camada de suspensão flutuando em um líquido denso, que na verdade tem pouco ou nenhum gradiente de densidade.

Outras aplicações

Uma centrífuga pode ser usada para isolar pequenas quantidades de sólidos retidos em suspensão de líquidos, como na separação de pó de giz da água. Na pesquisa biológica, pode ser usado na purificação de células de mamíferos, fracionamento de organelas subcelulares, fracionamento de vesículas de membrana, fracionamento de macromoléculas e complexos macromoleculares, etc. A centrifugação é usada de muitas maneiras diferentes na indústria de alimentos . Por exemplo, na indústria de laticínios, é normalmente usado na clarificação e desnatação do leite , extração de creme, produção e recuperação de caseína , produção de queijo , remoção de contaminantes bacterianos, etc. Esta técnica de processamento também é usada na produção de bebidas , sucos, café, chá, cerveja, vinho , leite de soja , beneficiamento / recuperação de óleo e gordura, manteiga de cacau , produção de açúcar, etc. Também é utilizado na clarificação e estabilização de vinhos .

Em laboratórios forenses e de pesquisa, pode ser usado na separação de urina e hemocomponentes . Também auxilia na separação de proteínas usando técnicas de purificação, como salting out , por exemplo, precipitação com sulfato de amônio. A centrifugação também é uma técnica importante no tratamento de resíduos , sendo um dos processos mais utilizados para a desidratação de lamas . Este processo também desempenha um papel na separação ciclônica , onde as partículas são separadas de um fluxo de ar sem o uso de filtros . Em um coletor de ciclone, o ar se move em uma trajetória helicoidal. As partículas com alta inércia são separadas pela força centrífuga, enquanto as partículas menores continuam com o fluxo de ar.

Centrífugas também têm sido usadas em pequeno grau para isolar compostos mais leves que a água, como o óleo. Em tais situações, a descarga aquosa é obtida na saída oposta, da qual sólidos com uma densidade maior que um são as substâncias alvo de separação.

História

Em 1923, Theodor Svedberg e seu aluno H. Rinde haviam analisado com sucesso sóis de grãos grandes em termos de sua sedimentação gravitacional. Os soles consistem em uma substância distribuída uniformemente em outra substância, também conhecida como colóide . No entanto, sóis de grãos menores, como os que contêm ouro, não puderam ser analisados. Para investigar esse problema, Svedberg desenvolveu uma centrífuga analítica, equipada com um sistema de absorção fotográfica, que exerceria um efeito centrífugo muito maior. Além disso, ele desenvolveu a teoria necessária para medir o peso molecular. Durante esse tempo, a atenção de Svedberg mudou do ouro para as proteínas.

Em 1900, era geralmente aceito que as proteínas eram compostas de aminoácidos; no entanto, se as proteínas eram colóides ou macromoléculas ainda estava em debate. Uma proteína que estava sendo investigada na época era a hemoglobina . Determinou-se que tinha 712 carbono, 1.130 hidrogênio, 243 oxigênio, dois átomos de enxofre e pelo menos um átomo de ferro. Isso deu à hemoglobina um peso resultante de aproximadamente 16.000 dalton (Da), mas era incerto se esse valor era um múltiplo de um ou quatro (dependendo do número de átomos de ferro presentes).

Por meio de uma série de experimentos utilizando a técnica de equilíbrio de sedimentação , duas observações importantes foram feitas: a hemoglobina tem um peso molecular de 68.000 Da, sugerindo que há quatro átomos de ferro presentes em vez de um, e que não importa onde a hemoglobina foi isolada, ela tinha exatamente o mesmo peso molecular. Como algo com uma massa molecular tão grande poderia ser encontrado de forma consistente, independentemente de onde foi coletado no corpo, era sem precedentes e favoreceu a ideia de que as proteínas são macromoléculas em vez de coloides. Para investigar esse fenômeno, foi necessária uma centrífuga com velocidades ainda maiores, e assim a ultracentrífuga foi criada para aplicar a teoria da sedimentação-difusão. A mesma massa molecular foi determinada, e a presença de um limite de propagação sugeriu que se tratava de uma única partícula compacta. A aplicação posterior da centrifugação mostrou que, sob diferentes condições, as grandes partículas homogêneas podiam ser divididas em subunidades discretas. O desenvolvimento da centrifugação foi um grande avanço na ciência experimental da proteína.

Linderstorm-Lang, em 1937, descobriu que tubos de gradiente de densidade podiam ser usados ​​para medições de densidade. Ele descobriu isso ao trabalhar com o vírus da anã amarela da batata. Esse método também foi usado no famoso experimento de Meselson e Stahl, no qual eles provaram que a replicação do DNA é semiconservadora usando diferentes isótopos de nitrogênio. Eles usaram centrifugação de gradiente de densidade para determinar qual isótopo ou isótopos de nitrogênio estavam presentes no DNA após os ciclos de replicação.

Veja também

Referências

Fontes

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