Célula tumoral circulante - Circulating tumor cell
Uma célula tumoral circulante ( CTC ) é uma célula que se espalhou na vasculatura ou nos vasos linfáticos de um tumor primário e é transportada pelo corpo na circulação sanguínea . As CTCs podem extravasar e se tornar sementes para o crescimento subsequente de tumores adicionais ( metástases ) em órgãos distantes, um mecanismo que é responsável pela grande maioria das mortes relacionadas ao câncer. A detecção e análise de CTCs podem auxiliar no prognóstico precoce do paciente e determinar os tratamentos adequados sob medida. Atualmente, existe um método aprovado pela FDA para detecção de CTC, CellSearch, que é usado para diagnosticar câncer de mama , colorretal e de próstata .
A detecção de CTCs, ou biópsia líquida , apresenta várias vantagens em relação às biópsias de tecidos tradicionais. Eles são não invasivos, podem ser usados repetidamente e fornecem informações mais úteis sobre o risco metastático, a progressão da doença e a eficácia do tratamento. Por exemplo, a análise de amostras de sangue de pacientes com câncer encontrou uma tendência para aumentar a detecção de CTC à medida que a doença progride. Os exames de sangue são fáceis e seguros de realizar e várias amostras podem ser coletadas ao longo do tempo. Por outro lado, a análise de tumores sólidos requer procedimentos invasivos que podem limitar a adesão do paciente. A capacidade de monitorar a progressão da doença ao longo do tempo pode facilitar a modificação apropriada na terapia do paciente, melhorando potencialmente seu prognóstico e qualidade de vida. O aspecto importante da capacidade de prognosticar a progressão futura da doença é a eliminação (pelo menos temporariamente) da necessidade de uma cirurgia quando as contagens repetidas de CTC são baixas e não aumentam; os benefícios óbvios de evitar a cirurgia incluem evitar o risco relacionado à genicidade inata do tumor nas cirurgias de câncer. Para este fim, foram desenvolvidas recentemente tecnologias com a sensibilidade e reprodutibilidade necessárias para detectar CTCs em pacientes com doença metastática. Por outro lado, as CTCs são muito raras, freqüentemente presentes como apenas algumas células por mililitro de sangue, o que torna sua detecção um tanto desafiadora. Além disso, muitas vezes expressam uma variedade de marcadores que variam de paciente para paciente, o que dificulta o desenvolvimento de técnicas com alta sensibilidade e especificidade .
Tipos
CTCs originadas de carcinomas (cânceres de origem epitelial, que são os mais prevalentes) podem ser classificadas de acordo com a expressão dos marcadores epiteliais, bem como seu tamanho e se são apoptóticos. Em geral, as CTCs são resistentes ao anoikis , o que significa que podem sobreviver na corrente sanguínea sem se prender a um substrato.
- As CTCs tradicionais são caracterizadas por um núcleo intacto e viável; a expressão de EpCAM e citoqueratinas , que demonstram origem epitelial; a ausência de CD45, indicando que a célula não é de origem hematopoiética; e seu tamanho maior , forma irregular ou morfologia subcelular.
- As CTCs citoqueratina-negativas são caracterizadas pela falta de EpCAM ou citoqueratinas, o que pode indicar um fenótipo indiferenciado ( células-tronco cancerígenas circulantes ) ou a aquisição de um fenótipo mesenquimal (conhecido como transição epitelial-mesenquimal ou EMT). Essas populações de CTCs podem ser as mais resistentes e propensas a metástases. Eles também são mais difíceis de isolar porque não expressam citoqueratinas nem CD45. Por outro lado, sua morfologia, expressão gênica e genômica são semelhantes às de outras células cancerosas.
- As CTCs apoptóticas são CTCs tradicionais que estão em apoptose (morte celular programada). Estes podem ser usados para monitorar a resposta ao tratamento, como feito experimentalmente pelo método Epic Sciences, que identifica a fragmentação nuclear ou bolha citoplasmática associada à apoptose. Medir a proporção de CTC tradicionais para CTCs apoptóticas - desde a linha de base até a terapia - fornece pistas para a eficácia do tratamento em direcionar e matar células cancerosas.
- As CTCs pequenas são positivas para citoqueratina e negativas para CD45, mas com tamanhos e formas semelhantes aos glóbulos brancos. É importante ressaltar que as pequenas CTCs têm biomarcadores específicos do câncer que as identificam como CTCs. As CTCs pequenas têm sido implicadas na doença progressiva e na diferenciação em carcinomas de células pequenas, que frequentemente requerem um curso terapêutico diferente.
Clusters CTC
Os clusters CTC são dois ou mais CTCs individuais ligados entre si. O cluster CTC pode conter CTCs tradicionais, pequenos ou CK-CTCs. Esses agrupamentos têm biomarcadores específicos do câncer que os identificam como CTCs. Vários estudos relataram que a presença desses aglomerados está associada a um aumento do risco metastático e mau prognóstico. Por exemplo, um estudo envolvendo câncer de próstata mostrou uma taxa de sobrevida média oito vezes maior para pacientes com apenas CTCs únicos em comparação com aqueles com clusters de CTC, enquanto outros estudos mostraram correlações semelhantes para câncer de cólon. Além disso, enumerar grupos de CTC pode fornecer informações prognósticas úteis para pacientes com níveis de CTC já elevados.
No entanto, um estudo relatou que, ao contrário do consenso existente, pelo menos uma população discreta desses agrupamentos não é maligna e deriva do endotélio tumoral. Esses aglomerados tumor-endoteliais circulantes também mostram marcadores epiteliais-mesenquimais, mas não refletem a genética do tumor primário.
Anteriormente, presumia-se que os aglomerados de CTC não podiam passar por vasos estreitos, como capilares, devido ao seu tamanho geral. No entanto, foi demonstrado que os clusters CTC podem "desenrolar-se" por meio de "clivagem seletiva de aderências intercelulares" para atravessar essas constrições em fila única e, em seguida, reverter o processo uma vez limpo. Este comportamento pode ser um fator que explica porque os clusters CTC têm um potencial metastático tão significativo.
Frequência
A detecção de CTCs pode ter importantes implicações prognósticas e terapêuticas, mas como seu número pode ser muito pequeno, essas células não são detectadas facilmente. Estima-se que entre as células que se desprenderam do tumor primário, apenas 0,01% podem formar metástases.
As células tumorais circulantes são encontradas em frequências da ordem de 1-10 CTC por mL de sangue total em pacientes com doença metastática. Para efeito de comparação, um mL de sangue contém alguns milhões de glóbulos brancos e um bilhão de glóbulos vermelhos. Esta baixa frequência, associada à dificuldade de identificação de células cancerosas, significa que um componente-chave para a compreensão das propriedades biológicas das CTCs requer tecnologias e abordagens capazes de isolar 1 CTC por mL de sangue, seja por enriquecimento, ou melhor ainda, com ensaios sem enriquecimento que identifiquem todos os subtipos CTC em definição suficientemente alta para satisfazer os requisitos de quantidade de imagem de patologia diagnóstica em pacientes com uma variedade de tipos de câncer. Até o momento, as CTCs foram detectadas em vários cânceres epiteliais (mama, próstata, pulmão e cólon) e as evidências clínicas indicam que os pacientes com lesões metastáticas são mais propensos a ter CTCs isoladas.
CTCs são geralmente (em 2011) capturados da vasculatura usando anticorpos específicos capazes de reconhecer marcadores tumorais específicos (geralmente EpCAM ); no entanto, esta abordagem é influenciada pela necessidade de uma expressão suficiente da proteína selecionada na superfície da célula, evento necessário para a etapa de enriquecimento. Além disso, uma vez que EpCAM e outras proteínas (por exemplo, citoqueratinas ) não são expressas em alguns tumores e podem ser reguladas para baixo durante a transição epitelial para mesenquimal ( EMT ), novas estratégias de enriquecimento são necessárias.
As primeiras evidências indicam que os marcadores CTC aplicados na medicina humana são conservados em outras espécies. Cinco dos marcadores mais comuns, incluindo CK19, também são úteis para detectar CTC no sangue de cães com tumores mamários malignos. Abordagens mais recentes são capazes de identificar mais células em 7,5 ml de sangue, como IsofFux ou Maintrac. Em casos muito raros, as CTCs estão presentes em quantidades grandes o suficiente para serem visíveis no esfregaço de sangue de rotina . Isso é conhecido como carcinocitemia ou leucemia de células de carcinoma e está associado a um mau prognóstico.
Métodos de detecção
Até o momento, uma variedade de métodos de pesquisa foram desenvolvidos para isolar e enumerar CTCs. A única metodologia aprovada pela FDA ( Food and Drug Administration ) dos Estados Unidos para enumeração de CTC no sangue total é o sistema CellSearch. Extensos testes clínicos feitos usando este método mostram que a presença de CTCs é um forte fator de prognóstico para a sobrevida global em pacientes com câncer de mama metastático, colorretal ou de próstata.
As CTCs são essenciais para a compreensão da biologia da metástase e prometem potencial como um biomarcador para avaliar de forma não invasiva a progressão do tumor e a resposta ao tratamento. No entanto, o isolamento e a caracterização de CTCs representam um grande desafio tecnológico, uma vez que CTCs constituem um número diminuto do total de células no sangue circulante, 1-10 CTCs por mL de sangue total em comparação com alguns milhões de leucócitos e um bilhão de sangue vermelho células. Portanto, o maior desafio para os pesquisadores do CTC é a dificuldade prevalecente de purificação do CTC que permite a caracterização molecular dos CTCs. Vários métodos foram desenvolvidos para isolar CTCs no sangue periférico e, essencialmente, caem em duas categorias: métodos biológicos e métodos físicos, bem como métodos híbridos que combinam as duas estratégias. As técnicas também podem ser classificadas com base na seleção de CTCs para isolamento (seleção positiva) ou na exclusão de todas as células sanguíneas (seleção negativa).
Métodos biológicos
Métodos biológicos isolam células com base na ligação de antígeno altamente específica, mais comumente por anticorpos monoclonais para seleção positiva. Foram usados anticorpos contra biomarcadores específicos de tumor, incluindo EpCAM , HER2 e PSA . A técnica mais comum é a separação baseada em nanopartículas magnéticas (ensaio imunomagnético), como usado em CellSearch ou MACS . Outras técnicas em pesquisa incluem separação microfluídica e combinação de ensaio imunomagnético e separação microfluídica. Conforme o desenvolvimento da tecnologia de microfabricação, estruturas magnéticas em microescala são implementadas para fornecer melhor controle do campo magnético e auxiliar na detecção de CTCs. Os vírus oncolíticos, como os vírus vaccinia, são desenvolvidos para detectar e identificar CTCs. Existem métodos alternativos que usam proteínas projetadas em vez de anticorpos, como a proteína VAR2CSA da malária , que se liga ao sulfato de condroitina oncofetal na superfície das CTCs. As CTCs também podem ser obtidas diretamente do sangue por uma técnica Seldinger modificada , desenvolvida por GILUPI GmbH. Um fio de metal revestido com anticorpo é inserido em uma veia periférica e permanece lá por um período definido (30 min). Durante esse tempo, as CTCs do sangue podem se ligar aos anticorpos (atualmente anti-EpCAM). Após o tempo de incubação, o fio é retirado, lavado e as CTCs nativas, isoladas do sangue do paciente, podem ser posteriormente analisadas. A genética molecular, bem como a coloração imunofluorescente e vários outros métodos são possíveis. A vantagem deste método é o maior volume de sangue que pode ser analisado para CTCs (aproximadamente 750 ml em 30 min em comparação com 7,5 ml de uma amostra de sangue coletada).
Método CellSearch
CellSearch é a única plataforma aprovada pela FDA para isolamento de CTC. Este método é baseado na utilização de nanopartículas de ferro revestidas com uma camada de polímero contendo análogos da biotina e conjugadas com anticorpos contra EpCAM para a captura de CTCs. O isolamento é acoplado a um analisador para obter imagens de células isoladas após sua coloração com conjugados de anticorpos fluorescentes específicos. O sangue é coletado em um tubo de EDTA com um conservante adicionado. Ao chegar ao laboratório, 7,5mL de sangue são centrifugados e colocados em um sistema de preparação. Este sistema primeiro enriquece as células tumorais imunomagneticamente por meio de nanopartículas de ferrofluido e um ímã. Posteriormente, as células recuperadas são permeabilizadas e coradas com uma coloração nuclear, um conjugado de anticorpo fluorescente contra CD45 (marcador de leucócito) e citoqueratinas 8 , 18 e 19 (marcadores epiteliais). A amostra é então digitalizada em um analisador que obtém imagens das manchas nucleares, de citoqueratina e de CD45. Para ser considerada uma CTC, uma célula deve conter um núcleo, ser positiva para a expressão citoplasmática da citoqueratina e negativa para a expressão do marcador CD45, e ter um diâmetro maior que 5 µm. Se o número total de células tumorais encontradas para atender aos critérios citados acima for 5 ou mais, uma amostra de sangue é positiva. Em estudos feitos em pacientes com câncer de próstata, mama e cólon, a sobrevida média de pacientes metastáticos com amostras positivas é cerca de metade da sobrevida média de pacientes metastáticos com amostras negativas. Este sistema é caracterizado por uma capacidade de recuperação de 93% e um limite de detecção de um CTC por 7,5 mL de sangue total. Para tipos específicos de câncer, métodos alternativos como o IsoFlux mostraram maior sensibilidade .
Método Parsortix
Este método automatizado usa filtração por tamanho para enriquecer células tumorais circulantes maiores e menos compressíveis de outros componentes do sangue. O sistema Parsortix pode coletar amostras de sangue que variam de 1 mL a 40 mL. Um cassete microfluídico descartável com um gap de 6,5 mícrons de altura permite que a grande maioria dos glóbulos vermelhos e brancos passem, enquanto células raras maiores, incluindo células tumorais circulantes e células fetais, são capturadas. As células presas podem ser coradas automaticamente com anticorpos para identificação ou podem ser liberadas do cassete. Essas células liberadas / colhidas estão vivas e podem ser analisadas por técnicas celulares e moleculares downstream, bem como cultivadas. O cassete de filtração captura uma infinidade de diferentes tipos de células cancerígenas.
Método das ciências épicas
Este método envolve tecnologia para separar células nucleadas de glóbulos vermelhos, que não têm núcleo. Todas as células nucleadas, incluindo glóbulos brancos normais e CTCs, são expostas a anticorpos marcados com fluorescência específicos para biomarcadores de câncer. Além disso, o sistema de imagem da Epic captura imagens de todas as células na lâmina (aproximadamente 3 milhões), registra as coordenadas precisas de cada célula e analisa cada célula para 90 parâmetros diferentes, incluindo a intensidade de fluorescência dos quatro marcadores fluorescentes e 86 diferentes parâmetros morfológicos. A Epic também pode usar FISH e outras técnicas de coloração para procurar anormalidades, como duplicações, deleções e rearranjos. A tecnologia de imagem e análise também permite que as coordenadas de cada célula em uma lâmina sejam conhecidas, de modo que uma única célula possa ser recuperada da lâmina para análise usando o sequenciamento de última geração. Um algoritmo treinado em hematopatologia incorpora numerosas medições de morfologia, bem como expressão de citoqueratina e CD45. O algoritmo então propõe CTCs candidatos que um leitor treinado confirma. As células de interesse são analisadas para marcadores fenotípicos e genotípicos relevantes, com glóbulos brancos regionais incluídos como controles negativos. Os ensaios moleculares da Epic medem a expressão da proteína e também interrogam as anormalidades genômicas nas CTCs para mais de 20 tipos diferentes de câncer.
Maintrac
Maintrac é uma plataforma de teste de sangue para diagnóstico que aplica métodos microscópicos de diagnóstico in vitro para identificar células raras em fluidos corporais e suas características moleculares. É baseado na seleção positiva usando anticorpos específicos da EpCAM. Maintrac usa uma abordagem baseada na identificação microscópica de células tumorais circulantes. Para evitar danos e perda das células durante o processo, a Maintrac utiliza apenas duas etapas para a identificação. Em contraste com muitos outros métodos, o maintrac não purifica as células ou as enriquece, mas as identifica no contexto de outros compostos do sangue. Para obter células vitais e reduzir o estresse dessas células, as células sanguíneas são preparadas por apenas uma etapa de centrifugação e lise de eritrócitos. Como o CellSearch, o maintrac usa um anticorpo EpCAM. No entanto, não é usado para enriquecimento, mas sim como um marcador fluorescente para identificar essas células. Juntamente com a coloração nuclear com iodeto de propídio, o método maintrac pode distinguir entre células vivas e mortas. Apenas propídio vital, excluindo células positivas para EpCAM, são contadas como células tumorais potenciais. Apenas células vivas podem se transformar em tumores, portanto, células EpCAM positivas morrendo não podem causar danos. A suspensão é analisada por microscopia de fluorescência, que conta automaticamente os eventos. Galerias de eventos simultâneos são gravadas para verificar se o software encontrou uma célula viva verdadeira e para diferenciar entre as células epiteliais da pele, por exemplo. A validação rigorosa do método mostrou que anticorpos adicionais de citoqueratinas ou CD45 não apresentavam qualquer vantagem.
Ao contrário de outros métodos, o maintrac não usa a contagem de células únicas como marcador de prognóstico, em vez disso, o Maintrac utiliza a dinâmica da contagem de células. O aumento do número de células tumorais é um fator importante para a continuidade da atividade tumoral. A diminuição da contagem de células é um sinal de uma terapia bem-sucedida. Portanto, o maintrac pode ser usado para verificar o sucesso de uma quimioterapia e para supervisionar o tratamento durante a terapia hormonal ou de manutenção. Maintrac tem sido usado experimentalmente para monitorar a recorrência do câncer. Estudos usando Maintrac mostraram que células epCAM positivas podem ser encontradas no sangue em pacientes sem câncer. Condições inflamatórias como a doença de Crohn também mostram níveis aumentados de células positivas para EpCAM. Pacientes com queimaduras cutâneas graves também podem transportar células epCAM positivas no sangue. Portanto, o uso de células EpCAM-positivas como uma ferramenta para o diagnóstico precoce não é ideal.
Métodos físicos
Os métodos físicos são frequentemente baseados em filtros, permitindo a captura de CTCs por tamanho em vez de por epítopos específicos . ScreenCell é um dispositivo baseado em filtração que permite o isolamento sensível e específico de CTCs de sangue total humano em poucos minutos. O sangue periférico é coletado e processado em 4 horas com um dispositivo de isolamento ScreenCell para capturar CTCs. As células capturadas estão prontas para cultura de células ou para caracterização direta usando o ensaio de hibridização in situ ViewRNA. O método Parsortix separa os CTCs com base em seu tamanho e deformabilidade.
Métodos híbridos
Os métodos híbridos combinam a separação física (por gradientes, campos magnéticos, etc.) com a recuperação de células mediada por anticorpos. Um exemplo disso é uma centrifugação de duplo gradiente sensível e detecção de classificação magnética de células e método de enumeração que tem sido usado para detectar células epiteliais de câncer circulantes em pacientes com câncer de mama por seleção negativa. O princípio da seleção negativa é baseado na recuperação de todas as células sanguíneas usando um painel de anticorpos, bem como centrifugação de gradiente tradicional com Ficoll . Um método semelhante conhecido como Teste ISET foi empregado para detectar células de câncer de próstata circulantes e outra técnica conhecida como RosetteStep foi usada para isolar CTCs de pacientes com câncer de pulmão de pequenas células . Da mesma forma, pesquisadores do Massachusetts General Hospital desenvolveram um método de seleção negativa que emprega foco inercial em um dispositivo microfluídico . A técnica, chamada CTC-iChip, primeiro remove células muito pequenas para serem CTCs, como os glóbulos vermelhos, e depois usa partículas magnéticas para remover os glóbulos brancos.
Caracterização CTC
Alguns medicamentos são particularmente eficazes contra cânceres que atendem a certos requisitos. Por exemplo, Herceptin é muito eficaz em pacientes Her2 positivos, mas muito menos eficaz em pacientes Her2 negativos. Uma vez que o tumor primário é removido, a biópsia do estado atual do câncer por meio da tipagem de tecido tradicional não é mais possível. Freqüentemente, seções de tecido do tumor primário, removidas anos antes, são usadas para fazer a tipagem. A caracterização adicional da CTC pode ajudar a determinar o fenótipo atual do tumor. Os ensaios de FISH foram realizados em CTC, bem como a determinação do status de IGF-1R , Her2, Bcl-2 , ERG , PTEN , AR usando imunofluorescência . O qPCR de nível de célula única também pode ser realizado com os CTCs isolados do sangue.
O tropismo de órgão de CTC derivado de paciente foi investigado em um modelo de camundongo. CTCs isoladas de pacientes com câncer de mama e expandidas in vitro mostraram que podem gerar metástases ósseas, pulmonares, ovárias e cerebrais em camundongos, refletindo parcialmente as lesões secundárias encontradas nos pacientes correspondentes. Notavelmente, uma linha CTC - isolada muito antes do aparecimento de metástases cerebrais no paciente - era altamente competente para gerar metástases cerebrais em camundongos. Este foi o primeiro caso preditivo de metástase cerebral e uma prova de conceito de que as características moleculares intrínsecas dos precursores metastáticos entre as CTCs poderiam fornecer novos insights sobre os mecanismos da metástase.
Morfologia celular
A aparência morfológica é avaliada por operadores humanos e, portanto, está sujeita a uma grande variação entre operadores. Existem vários métodos de enumeração de CTC que usam a aparência morfológica para identificar a CTC, que também pode aplicar diferentes critérios morfológicos. Um estudo recente sobre câncer de próstata mostrou que muitas definições morfológicas diferentes de células tumorais circulantes têm valor prognóstico semelhante, embora o número absoluto de células encontradas em pacientes e doadores normais varie em mais de uma década entre as diferentes definições morfológicas.
História
As CTCs foram observadas pela primeira vez em 1869 no sangue de um homem com câncer metastático por Thomas Ashworth, que postulou que "células idênticas às do próprio câncer sendo vistas no sangue podem tender a lançar alguma luz sobre o modo de origem de múltiplos tumores existentes na mesma pessoa ". Uma comparação completa da morfologia das células circulantes com as células tumorais de diferentes lesões levou Ashworth a concluir que "Uma coisa é certa, se eles [CTC] vieram de uma estrutura existente de câncer, devem ter passado pela maior parte do sistema circulatório ter chegado à veia safena interna da perna sã ".
A importância das CTCs na pesquisa moderna do câncer começou em meados da década de 1990 com a demonstração de que as CTCs existem no início do curso da doença. Esses resultados foram possíveis pela tecnologia de separação magnética extremamente sensível que emprega ferrofluidos (nanopartículas magnéticas coloidais) e separadores magnéticos de alto gradiente inventados por Paul Liberti e motivados por cálculos teóricos de Liberti e Leon Terstappen que indicaram tumores muito pequenos desprendendo células a menos de 1,0% por dia deve resultar em células detectáveis no sangue. Uma variedade de outras tecnologias foram aplicadas à enumeração e identificação da CTC desde então.
A pesquisa moderna do câncer demonstrou que as CTCs derivam de clones no tumor primário, validando as observações de Ashworth. Os esforços significativos colocados na compreensão das propriedades biológicas das CTCs demonstraram o papel crítico que as células tumorais circulantes desempenham na disseminação metastática do carcinoma . Além disso, a análise de célula única altamente sensível demonstrou um alto nível de heterogeneidade visto no nível de célula única para expressão e localização de proteína e as CTCs refletiram tanto a biópsia primária quanto as alterações observadas nos locais metastáticos.