DNA complementar - Complementary DNA

Saída de um microarray de cDNA usado em testes

Em genética , o DNA complementar ( cDNA ) é o DNA sintetizado a partir de um molde de RNA de fita simples (por exemplo, RNA mensageiro ( mRNA ) ou microRNA (miRNA)) em uma reação catalisada pela enzima transcriptase reversa . O cDNA é freqüentemente usado para clonar genes eucarióticos em procariotos . Quando os cientistas desejam expressar uma proteína específica em uma célula que normalmente não expressa aquela proteína (isto é, expressão heteróloga ), eles transferem o cDNA que codifica a proteína para a célula receptora. Na biologia molecular, o cDNA também é gerado para analisar perfis transcriptômicos em tecido em massa, células únicas ou núcleos únicos em ensaios como microarrays e RNA-seq .

O cDNA também é produzido naturalmente por retrovírus (como HIV-1 , HIV-2 , vírus da imunodeficiência símia , etc.) e, em seguida, integrado ao genoma do hospedeiro, onde cria um provírus .

O termo cDNA também é usado, tipicamente em um contexto de bioinformática , para se referir a uma sequência de transcrito de mRNA, expressa como bases de DNA (desoxi-GCAT) em vez de bases de RNA (GCAU).

Síntese

O RNA serve como molde para a síntese de cDNA. Na vida celular, o cDNA é gerado por vírus e retrotransposons para integração do RNA no DNA genômico alvo . Na biologia molecular, o RNA é purificado do material de origem após a remoção do DNA genômico, proteínas e outros componentes celulares. O cDNA é então sintetizado através da transcrição reversa in vitro .

Purificação de RNA

O RNA é transcrito do DNA genômico em células hospedeiras e é extraído primeiro por lise das células e depois purificando o RNA utilizando métodos amplamente utilizados, como fenol-clorofórmio, coluna de sílica e métodos de extração de RNA baseados em esferas. Os métodos de extração variam dependendo do material de origem. Por exemplo, a extração de RNA de tecido vegetal requer reagentes adicionais, como polivinilpirrolidona (PVP), para remover compostos fenólicos, carboidratos e outros compostos que, de outra forma, tornariam o RNA inutilizável. Para remover DNA e proteínas, enzimas como DNase e Proteinase K são usadas para degradação. É importante ressaltar que a integridade do RNA é mantida pela inativação de RNases com agentes caotrópicos, como isotiocianato de guanidínio, dodecil sulfato de sódio (SDS), fenol ou clorofórmio. O RNA total é então separado de outros componentes celulares e precipitado com álcool. Existem vários kits comerciais para extrações simples e rápidas de RNA para aplicações específicas. Métodos adicionais baseados em grânulos podem ser usados ​​para isolar subtipos específicos de RNA (por exemplo, mRNA e microRNA ) com base no tamanho ou em regiões únicas de RNA.

Transcrição reversa

Síntese da primeira fita

Usando uma enzima de transcriptase reversa e modelos de RNA purificados, uma fita de cDNA é produzida (síntese da primeira fita de cDNA). A transcriptase reversa M-MLV do vírus da leucemia murina Moloney é comumente usada devido à sua atividade RNase H reduzida adequada para a transcrição de RNAs mais longos. A transcriptase reversa AMV do vírus da mieloblastose aviária também pode ser usada para modelos de RNA com fortes estruturas secundárias (isto é, alta temperatura de fusão). O cDNA é comumente gerado a partir do mRNA para análises de expressão gênica, como RT-qPCR e RNA-seq . O mRNA é seletivamente reverso transcrito usando oligo-d T primers que são o complemento reverso da cauda poli-adenilada na extremidade 3 'de todo mRNA. Uma mistura otimizada de oligo-dT e iniciadores hexâmeros aleatórios aumenta a chance de obtenção de cDNA de comprimento total enquanto reduz o viés de 5 'ou 3'. O RNA ribossomal também pode ser esgotado para enriquecer tanto o mRNA quanto os transcritos não poli-adenilados, como alguns RNAs não codificantes .

Síntese de segunda fita

O resultado da síntese da primeira fita, híbridos de RNA-DNA, pode ser processado por meio de vários métodos de síntese da segunda fita ou processado diretamente em ensaios a jusante. Um método inicial conhecido como síntese com iniciação em grampo de cabelo baseou-se na formação de grampo de cabelo na extremidade 3 'da primeira fita de cDNA para iniciar a síntese de segunda fita. No entanto, o priming é aleatório e a hidrólise em grampo leva à perda de informações. O procedimento de Gubler e Hoffman usa E. Coli RNase H para cortar mRNA que é substituído por E. Coli DNA Polimerase I e selado com E. Coli DNA Ligase . Uma otimização deste procedimento baseia-se na baixa atividade de RNase H de M-MLV para cortar o mRNA com o restante do RNA removido posteriormente pela adição de RNase H após a tradução da polimerase de DNA da segunda fita de cDNA. Isso evita a perda de informações de sequência na extremidade 5 'do mRNA.

Formulários

O DNA complementar é freqüentemente usado na clonagem de genes ou como sondas de genes ou na criação de uma biblioteca de cDNA . Quando os cientistas transferem um gene de uma célula para outra para expressar o novo material genético como uma proteína na célula receptora, o cDNA será adicionado ao receptor (em vez de ao gene inteiro), porque o DNA de um gene inteiro pode incluir DNA que não codifica para a proteína ou que interrompe a sequência de codificação da proteína (por exemplo, íntrons ). As sequências parciais de cDNAs são frequentemente obtidas como marcadores de sequência expressa .

Com a amplificação de sequências de DNA por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) agora comum, normalmente se realiza a transcrição reversa como uma etapa inicial, seguida por PCR para obter uma sequência exata de cDNA para expressão intracelular. Isto é conseguido através da concepção de iniciadores de DNA específicos para sequências que hibridizam com as extremidades 5 'e 3' de uma região de cDNA que codifica para uma proteína. Uma vez amplificada, a sequência pode ser cortada em cada extremidade com nucleases e inserida em uma das muitas pequenas sequências circulares de DNA conhecidas como vetores de expressão. Esses vetores permitem a auto-replicação, dentro das células, e potencialmente a integração no DNA do hospedeiro. Eles normalmente também contêm um promotor forte para conduzir a transcrição do cDNA alvo em mRNA, que é então traduzido em proteína.

Em 13 de junho de 2013, a Suprema Corte dos Estados Unidos decidiu no caso Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, embora os genes humanos de ocorrência natural não possam ser patenteados , o cDNA é elegível para patente porque não ocorre naturalmente.

O cDNA também é usado para estudar a expressão gênica por meio de métodos como RNA-seq ou RT-qPCR . Para sequenciamento, o RNA deve ser fragmentado devido às limitações de tamanho da plataforma de sequenciamento. Além disso, a segunda fita de cDNA sintetizada deve ser ligada a adaptadores que permitem que fragmentos de cDNA sejam amplificados por PCR e se liguem a células de fluxo de sequenciamento. Os métodos de análise de genes específicos geralmente usam microarrays e RT-qPCR para quantificar os níveis de cDNA por meio de métodos fluorométricos e outros.

Vírus e retrotransposons

Alguns vírus também usam cDNA para transformar seu RNA viral em mRNA (RNA viral → cDNA → mRNA). O mRNA é usado para fazer proteínas virais para assumir o controle da célula hospedeira.

Um exemplo deste primeiro passo do DNA viral para o cDNA pode ser visto no ciclo de infecção do HIV. Aqui, a membrana da célula hospedeira se liga ao envelope lipídico do vírus, o que permite que o capsídeo viral com duas cópias do RNA do genoma viral entre no hospedeiro. A cópia do cDNA é então feita através da transcrição reversa do RNA viral, um processo facilitado pela chaperona CypA e uma transcriptase reversa associada ao capsídeo viral.

O cDNA também é gerado por retrotransposons em genomas eucarióticos. Retrotransposons são elementos genéticos móveis que se movem dentro, e às vezes entre, genomas por meio de intermediários de RNA. Este mecanismo é compartilhado com os vírus com exclusão da geração de partículas infecciosas.

Veja também

Referências

Mark D. Adams et al. “Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project.” Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. Rede.

Philip M. Murphy e H. Lee Tiffany. "Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor." Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. Rede.

links externos