Nocaute de gene condicional - Conditional gene knockout
O knockout condicional de genes é uma técnica usada para eliminar um gene específico em um determinado tecido, como o fígado. Esta técnica é útil para estudar o papel de genes individuais em organismos vivos. Ele difere do nocaute de gene tradicional porque tem como alvo genes específicos em momentos específicos, em vez de ser excluído desde o início da vida. Usar a técnica de nocaute de gene condicional elimina muitos dos efeitos colaterais do nocaute de gene tradicional . No gene knockout tradicional, pode ocorrer a morte embrionária por uma mutação genética , o que impede os cientistas de estudar o gene em adultos. Alguns tecidos não podem ser estudados adequadamente de forma isolada, então o gene deve estar inativo em um determinado tecido enquanto permanece ativo em outros. Com essa tecnologia, os cientistas são capazes de nocautear genes em um estágio específico de desenvolvimento e estudar como o nocaute de um gene em um tecido afeta o mesmo gene em outros tecidos.
Técnica
A técnica mais comumente usada é o sistema de recombinação Cre-lox. A enzima Cre recombinase reconhece especificamente dois locais lox (loci de recombinação) dentro do DNA e causa a recombinação entre eles. Durante a recombinação, duas fitas de DNA trocam informações. Essa recombinação causará uma deleção ou inversão dos genes entre os dois sítios lox, dependendo de sua orientação. Um gene inteiro pode ser removido para inativá-lo. Todo esse sistema é indutível, de modo que uma substância química pode ser adicionada para eliminar os genes em um momento específico. Dois dos produtos químicos mais comumente usados são a tetraciclina, que ativa a transcrição do gene Cre recombinase e o tamoxifeno, que ativa o transporte da proteína Cre recombinase para o núcleo. Apenas alguns tipos de células expressam a recombinase Cre e nenhuma célula de mamíferos a expressa, portanto, não há risco de ativação acidental de locais lox ao usar o nocaute de gene condicional em mamíferos. Descobrir como expressar a Cre-recombinase em um organismo tende a ser a parte mais difícil desta técnica.
Usos
O método de nocaute de gene condicional é freqüentemente usado para modelar doenças humanas em outros mamíferos. Isso aumentou a capacidade dos cientistas de estudar doenças, como o câncer, que se desenvolvem em tipos específicos de células ou estágios de desenvolvimento. Sabe-se que mutações no gene BRCA1 estão ligadas ao câncer de mama. Os cientistas usaram o nocaute do gene condicional para excluir o alelo BRCA1 no tecido da glândula mamária em camundongos e descobriram que ele desempenha um papel importante na supressão do tumor.
Um gene específico no cérebro de camundongos que se pensava estar envolvido no início da doença de Alzheimer, que codifica a enzima cinase 5 dependente da ciclina (Cdk5), foi eliminado. Esses ratos foram considerados "mais inteligentes" do que os ratos normais e foram capazes de lidar com tarefas complexas de forma mais inteligente em comparação com os ratos "normais" criados em laboratório.
Projeto Knockout Mouse (KOMP)
Nocautes genéticos condicionais em camundongos são freqüentemente usados para estudar doenças humanas porque muitos genes produzem fenótipos semelhantes em ambas as espécies. Nos últimos 100 anos, a genética de camundongos de laboratório tem sido usada para isso porque os camundongos são mamíferos fisiologicamente semelhantes o suficiente aos humanos para gerar testes qualitativos. Esses dois têm genes tão semelhantes que, de 4.000 genes estudados, apenas 10 foram encontrados em uma espécie, mas não na outra. Todos os mamíferos compartilharam o mesmo ancestral comum há aproximadamente 80 milhões de anos; tecnicamente falando, todos os genomas de mamíferos são comparativamente semelhantes. No entanto, em comparação entre camundongos e humanos, suas regiões codificadoras de proteínas dos genomas são 85% idênticas e têm semelhanças entre 99% de seus homólogos. Essas semelhanças resultam em fenótipos semelhantes a serem expressos entre as duas espécies. [8] [12] Seus genes são muito semelhantes aos dos humanos, com 99% dos homólogos sendo semelhantes. Além de produzir fenótipos semelhantes, também os torna candidatos muito promissores para nocautes de genes condicionais. [8] O objetivo do KOMP é criar mutações nocaute nas células-tronco embrionárias para cada um dos 20.000 genes codificadores de proteínas em camundongos. Os genes são desativados porque esta é a melhor maneira de estudar sua função e aprender mais sobre seu papel nas doenças humanas. Existem duas estratégias principais para o nocaute de gene condicional: direcionamento de genes ou recombinação homóloga e captura de genes. Ambos os métodos geralmente têm um vetor viral modificado ou um fragmento linear como o modo de transporte do DNA artificial para a célula ES alvo. As células então crescem em uma placa de Petri por vários dias e são inseridas nos embriões em estágio inicial. Por último, os embriões são colocados no útero da mulher adulta, onde podem crescer e se tornar seus descendentes. [9] Alguns alelos neste projeto não podem ser nocauteados usando métodos tradicionais e requerem a especificidade da técnica de nocaute de gene condicional. Outros métodos combinatórios são necessários para eliminar os últimos alelos restantes. O nocaute condicional do gene é um procedimento demorado e há projetos adicionais que se concentram em nocautear os genes restantes do camundongo. O contribuidor do projeto KOMP, Oliver Smithies, provavelmente forneceu o maior impacto científico sobre o direcionamento desse gene. Oliver recebeu o prêmio Nobel de medicina por uma técnica que permite identificar funções em genes e como usar o método de 'nocaute' para deletar certos genes. Infelizmente, o pioneiro no direcionamento de genes morreu aos 91 anos de idade em 10 de janeiro de 2017. [11] O KOMP projetado foi iniciado em 2006 e continua até hoje. O Repositório KOMP fornece incentivos para aqueles que participam dos projetos para devolver feedback a eles e aqueles que atendem a critérios específicos podem ser reembolsados em 50% do custo de suas células de pesquisa. [10]
Referências
8. Austin, CP, Battey, JF, Bradley, A., Bucan, M., Capecchi, M., Collins, FS, Dove, WF, Duyk, G., Dymecki, S., Eppig, JT, Grieder, FB , Heintz, N., Hicks, G., Insel, TR, Joyner, A., Koller, BH, Lloyd, KC, Magnuson, T., Moore, MW, Nagy, A.,… Zambrowicz, B. (2004) . O projeto do mouse nocaute. Nature genetics, 36 (9), 921–924. https://doi.org/10.1038/ng0904-921
9. Folha de informações sobre ratos nocaute. (WL). Obtido em https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet
10. Lloyd KC (2011). Um excelente recurso de mouse para a comunidade de pesquisa biomédica. Anais da Academia de Ciências de Nova York, 1245, 24–26. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.06311.x
11. O vencedor do Prêmio Nobel, Dr. Oliver Smithies, fará a palestra Earl H. Morris Endowed Lecture em 10 de julho. (Nd). Obtido em https://medicine.wright.edu/about/article/2009/smithieslecture
12. NIH. (WL). Por que o mouse é importante. Obtido em https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome