Microscopia de campo escuro - Dark-field microscopy
A microscopia de campo escuro (também chamada de microscopia de solo escuro ) descreve os métodos de microscopia , tanto na microscopia de luz quanto na eletrônica , que excluem o feixe não espalhado da imagem. Como resultado, o campo ao redor da amostra (ou seja, onde não há amostra para espalhar o feixe) é geralmente escuro.
Em microscópios ópticos, uma lente condensadora de campo escuro deve ser usada, o que direciona um cone de luz para longe da lente objetiva. Para maximizar o poder de coleta de luz dispersa da lente objetiva, é usada a imersão em óleo e a abertura numérica (NA) da lente objetiva deve ser inferior a 1,0. Lentes objetivas com um NA mais alto podem ser usadas, mas apenas se tiverem um diafragma ajustável, o que reduz o NA. Freqüentemente, essas lentes objetivas têm um NA que varia de 0,7 a 1,25.
Aplicações de microscopia de luz
Na microscopia óptica , o campo escuro descreve uma técnica de iluminação usada para aumentar o contraste em amostras não coradas . Ele funciona iluminando a amostra com luz que não será coletada pela lente objetiva e, portanto, não fará parte da imagem. Isso produz a aparência clássica de um fundo escuro, quase preto, com objetos brilhantes.
O caminho da luz
As etapas são ilustradas na figura onde um microscópio invertido é usado.
- A luz entra no microscópio para iluminação da amostra.
- Um disco de tamanho especial, o patch stop (veja a figura), bloqueia parte da luz da fonte de luz, deixando um anel externo de iluminação. Um anel de fase largo também pode ser razoavelmente substituído em baixa ampliação.
- A lente do condensador focaliza a luz na direção da amostra.
- A luz entra na amostra. A maior parte é transmitida diretamente, enquanto parte é espalhada pela amostra.
- A luz dispersa entra na lente objetiva, enquanto a luz transmitida diretamente simplesmente perde a lente e não é coletada devido a um bloco de iluminação direta (veja a figura).
- Apenas a luz espalhada passa a produzir a imagem, enquanto a luz transmitida diretamente é omitida.
Vantagens e desvantagens
A microscopia de campo escuro é uma técnica muito simples, mas eficaz, e bem adequada para o uso que envolve amostras biológicas vivas e não coradas , como esfregaço de uma cultura de tecidos ou organismos individuais de base aquosa e unicelulares. Considerando a simplicidade do setup, a qualidade das imagens obtidas com esta técnica impressiona.
Uma limitação da microscopia de campo escuro são os baixos níveis de luz vistos na imagem final. Isso significa que a amostra deve ser fortemente iluminada, o que pode causar danos à amostra.
As técnicas de microscopia de campo escuro são quase inteiramente livres de halo ou artefatos em relevo típicos de DIC e imagens de contraste de fase. Isso prejudica a sensibilidade às informações de fase.
A interpretação das imagens de campo escuro deve ser feita com muito cuidado, pois as características escuras comuns das imagens de microscopia de campo claro podem ser invisíveis e vice-versa. Em geral, a imagem de campo escuro carece das baixas frequências espaciais associadas à imagem de campo claro, tornando a imagem uma versão de passagem alta da estrutura subjacente.
Embora a imagem do campo escuro possa inicialmente parecer um negativo da imagem do campo claro, diferentes efeitos são visíveis em cada uma. Na microscopia de campo claro, as características são visíveis onde uma sombra é projetada na superfície pela luz incidente ou uma parte da superfície é menos reflexiva, possivelmente pela presença de marcas ou arranhões. Os recursos elevados que são suaves demais para projetar sombras não aparecerão em imagens de campo claro, mas a luz que se reflete nas laterais do recurso será visível nas imagens de campo escuro.
- Comparação de técnicas de transiluminação usadas para gerar contraste em uma amostra de papel de seda (1,559 μm / pixel quando visualizado em resolução total)
Iluminação de campo escuro, o contraste da amostra vem da luz espalhada pela amostra
Iluminação de luz polarizada cruzada , o contraste da amostra vem da rotação da luz polarizada através da amostra
Iluminação de contraste de fase, o contraste da amostra vem da interferência de diferentes comprimentos de caminho de luz através da amostra
Uso em computação
A microscopia de campo escuro foi recentemente aplicada em dispositivos apontadores de mouse de computador para permitir que o mouse funcione em vidro transparente por meio de imagens de falhas microscópicas e poeira na superfície do vidro.
Microscopia de campo escuro combinada com imagem hiperespectral
Quando acoplada à imagem hiperespectral , a microscopia de campo escuro se torna uma ferramenta poderosa para a caracterização de nanomateriais embutidos nas células. Em uma publicação recente, Patskovsky et al. usou esta técnica para estudar a fixação de nanopartículas de ouro (AuNPs) visando células cancerosas CD44 +.
Aplicações de microscópio eletrônico de transmissão
Os estudos de campo escuro em microscopia eletrônica de transmissão desempenham um papel poderoso no estudo de cristais e defeitos de cristal, bem como na imagem de átomos individuais.
Imagem convencional de campo escuro
Resumidamente, a imagem envolve a inclinação da iluminação incidente até que um feixe difratado, ao invés do incidente, passe através de uma pequena abertura objetiva no plano focal posterior da lente objetiva. As imagens de campo escuro, nessas condições, permitem mapear a intensidade difratada proveniente de uma única coleção de planos difratores em função da posição projetada no corpo de prova e em função da inclinação do corpo de prova.
Em espécimes de cristal único, imagens de campo escuro de reflexão única de um espécime inclinado para fora da condição de Bragg permitem "iluminar" apenas os defeitos de rede, como deslocamentos ou precipitados, que dobram um único conjunto de planos de rede em sua vizinhança . A análise das intensidades em tais imagens pode então ser usada para estimar a quantidade dessa dobra. Em espécimes policristalinos, por outro lado, as imagens de campo escuro servem para iluminar apenas aquele subconjunto de cristais que refletem Bragg em uma determinada orientação.
| Animação: imagem em campo escuro de cristais |
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| Esta animação ilustra o movimento de uma abertura (centrada na figura laranja à esquerda) sobre o espectro de potência (um substituto digital para o padrão de difração óptica do plano focal posterior) mostrado com o pico DC (ou feixe não espalhado) abaixo do centro. Apenas nanocristais com periodicidades projetadas que difratam na abertura iluminam-se na imagem de campo escuro à direita. A abertura está se movendo em incrementos de 1,25 ° ao redor do anel associado à difração de espaçamentos de rede de 2,3 Å (111) de ouro . |
Imagem de feixe fraco
A imagem de feixe fraco envolve óptica semelhante ao campo escuro convencional, mas usa um feixe harmônico difratado em vez do próprio feixe difratado. Desta forma, pode ser obtida uma resolução muito maior de regiões tensionadas em torno dos defeitos.
Imagem anular de campo escuro de ângulo baixo e alto
A imagem de campo escuro anular requer que se formem imagens com elétrons difratados em uma abertura anular centrada, mas não incluindo, o feixe não espalhado. Para grandes ângulos de espalhamento em um microscópio eletrônico de transmissão de varredura , isso às vezes é chamado de imagem de contraste Z por causa do espalhamento aprimorado de átomos de alto número atômico.
Análise digital de campo escuro
Trata-se de uma técnica matemática intermediária entre o espaço direto e recíproco (transformada de Fourier) para explorar imagens com periodicidades bem definidas, como imagens de franja em rede de microscópio eletrônico. Tal como acontece com a imagem analógica de campo escuro em um microscópio eletrônico de transmissão, ela permite "iluminar" os objetos no campo de visão onde residem as periodicidades de interesse. Ao contrário da imagem analógica de campo escuro, também pode permitir mapear a fase de Fourier das periodicidades e, portanto, os gradientes de fase, que fornecem informações quantitativas sobre a tensão da rede vetorial.
Veja também
Notas de rodapé
links externos
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Recursos de biblioteca sobre microscopia de campo escuro |
- Nikon - Estereomicroscopia> Iluminação de campo escuro
- Expressões Moleculares
- Darkfield Illumination Primer
- Gage SH . 1920. Microscopia de campo escuro moderna e a história de seu desenvolvimento . Transactions of the American Microscopical Society 39 (2): 95–141.
- Microscópios de campo escuro e contraste de fase (Université Paris Sud)