Desnaturação (bioquímica) - Denaturation (biochemistry)

Os efeitos da temperatura na atividade enzimática . Topo - o aumento da temperatura aumenta a taxa de reação ( coeficiente Q10 ). Meio - a fração da enzima dobrada e funcional diminui acima de sua temperatura de desnaturação. Inferior - conseqüentemente, a taxa ótima de reação de uma enzima está em uma temperatura intermediária.
Definição IUPAC

Processo de alteração parcial ou total das estruturas nativas secundárias e / ou terciárias e / ou quaternárias de proteínas ou ácidos nucleicos, resultando em uma perda de bioatividade .

Nota 1 : Modificado da definição dada na ref.

Nota 2 : A desnaturação pode ocorrer quando proteínas e ácidos nucléicos são submetidos a temperatura elevada ou a extremos de pH, ou a concentrações não fisiológicas de sal, solventes orgânicos, ureia ou outros agentes químicos.

Nota 3 : Uma enzima perde sua atividade catalítica quando é desnaturada.

A desnaturação é um processo no qual proteínas ou ácidos nucleicos perdem a estrutura quaternária , estrutura terciária e estrutura secundária que está presente em seu estado nativo , pela aplicação de algum estresse externo ou composto, como um ácido ou base forte , um sal inorgânico concentrado , um solvente orgânico (por exemplo, álcool ou clorofórmio ), agitação e radiação ou calor . Se as proteínas em uma célula viva são desnaturadas, isso resulta na interrupção da atividade celular e possivelmente na morte celular. A desnaturação das proteínas também é consequência da morte celular. As proteínas desnaturadas podem exibir uma ampla gama de características, desde mudança conformacional e perda de solubilidade até agregação devido à exposição de grupos hidrofóbicos . As proteínas desnaturadas perdem sua estrutura 3D e, portanto, não podem funcionar.

O enovelamento de proteínas é a chave para saber se uma proteína globular ou de membrana pode fazer seu trabalho corretamente; deve ser dobrado na forma certa para funcionar. No entanto, as ligações de hidrogênio , que desempenham um grande papel no dobramento, são bastante fracas e, portanto, facilmente afetadas pelo calor, acidez, concentrações variáveis ​​de sal e outros fatores de estresse que podem desnaturar a proteína. Esse é um dos motivos pelos quais a homeostase é fisiologicamente necessária em muitas formas de vida .

Esse conceito não está relacionado ao álcool desnaturado , que é álcool que foi misturado com aditivos para torná-lo impróprio para consumo humano.

Exemplos comuns

(Topo) A proteína albumina da clara do ovo sofre desnaturação e perda de solubilidade quando o ovo é cozido. (Abaixo) Os clipes de papel fornecem uma analogia visual para ajudar na conceituação do processo de desnaturação.

Quando o alimento é cozido, algumas de suas proteínas se tornam desnaturadas. É por isso que os ovos cozidos ficam duros e a carne cozida fica firme.

Um exemplo clássico de desnaturação de proteínas vem das claras de ovo, que são, em grande parte, albuminas de ovo em água. Frescas dos ovos, as claras são transparentes e líquidas. Cozinhar os brancos termicamente instáveis os torna opacos, formando uma massa sólida interconectada. A mesma transformação pode ser efetuada com um produto químico desnaturante. Despejar claras de ovo em um copo de acetona também tornará as claras translúcidas e sólidas. A pele que se forma no leite coalhado é outro exemplo comum de proteína desnaturada. O aperitivo frio conhecido como ceviche é preparado “cozinhando” quimicamente peixes crus e mariscos numa marinada cítrica ácida, sem calor.

Desnaturação de proteínas

As proteínas desnaturadas podem exibir uma ampla gama de características, desde a perda de solubilidade até a agregação de proteínas .

As proteínas funcionais têm quatro níveis de organização estrutural:
1) Estrutura primária: a estrutura linear dos aminoácidos na cadeia polipeptídica
2) Estrutura secundária: ligações de hidrogênio entre cadeias de grupos peptídicos em uma hélice alfa ou folha beta
3) Estrutura terciária: tridimensional estrutura de hélices alfa e hélices beta dobradas
4) Estrutura quaternária: estrutura tridimensional de polipeptídeos múltiplos e como eles se encaixam
Processo de desnaturação:
1) Proteína funcional apresentando estrutura quaternária
2) Quando o calor é aplicado, altera as ligações intramoleculares da proteína
3) Desdobramento dos polipeptídeos (aminoácidos)

Fundo

Proteínas ou polipeptídeos são polímeros de aminoácidos . Uma proteína é criada por ribossomos que "lêem" o RNA que é codificado por códons no gene e montam a combinação de aminoácidos necessária a partir da instrução genética , em um processo conhecido como tradução . A fita de proteína recém-criada então sofre modificação pós-tradução , na qual átomos ou moléculas adicionais são adicionados, por exemplo cobre , zinco ou ferro . Uma vez que esse processo de modificação pós-tradução foi concluído, a proteína começa a se dobrar (às vezes espontaneamente e às vezes com assistência enzimática ), enrolando-se sobre si mesma de modo que os elementos hidrofóbicos da proteína são enterrados profundamente dentro da estrutura e os elementos hidrofílicos acabam no lado de fora. A forma final de uma proteína determina como ela interage com seu ambiente.

O dobramento de proteínas consiste em um equilíbrio entre uma quantidade substancial de interações intramoleculares fracas dentro de uma proteína (interações hidrofóbicas, eletrostáticas e de Van Der Waals) e interações proteína-solvente. Como resultado, este processo depende fortemente do estado ambiental em que a proteína reside. Essas condições ambientais incluem, e não estão limitadas a, temperatura , salinidade , pressão e os solventes que por acaso estão envolvidos. Conseqüentemente, qualquer exposição a estresses extremos (por exemplo, calor ou radiação, altas concentrações de sal inorgânico, ácidos e bases fortes) pode interromper a interação de uma proteína e inevitavelmente levar à desnaturação.

Quando uma proteína é desnaturada, as estruturas secundárias e terciárias são alteradas, mas as ligações peptídicas da estrutura primária entre os aminoácidos permanecem intactas. Uma vez que todos os níveis estruturais da proteína determinam sua função, a proteína não pode mais desempenhar sua função uma vez que foi desnaturada. Isto está em contraste com proteínas intrinsecamente não estruturadas , que são desdobradas em seu estado nativo , mas ainda funcionalmente ativas e tendem a se dobrar ao se ligarem ao seu alvo biológico.

Como ocorre a desnaturação nos níveis da estrutura da proteína

Veja também: Estrutura da proteína
  • Na desnaturação da estrutura secundária , as proteínas perdem todos os padrões de repetição regulares, como alfa-hélices e folhas pregueadas beta , e adotam uma configuração de bobina aleatória .
  • A estrutura primária , como a sequência de aminoácidos mantidos juntos por ligações peptídicas covalentes, não é interrompida pela desnaturação.

    • Perda de função

    A maioria dos substratos biológicos perdem sua função biológica quando desnaturados. Por exemplo, as enzimas perdem sua atividade , porque os substratos não podem mais se ligar ao sítio ativo e porque os resíduos de aminoácidos envolvidos nos estados de transição dos substratos estabilizadores não estão mais posicionados para fazer isso. O processo de desnaturação e a perda de atividade associada podem ser medidos usando técnicas como interferometria de polarização dupla , CD , QCM-D e MP-SPR .

    Perda de atividade devido a metais pesados ​​e metalóides

    Ao direcionar as proteínas, os metais pesados ​​são conhecidos por interromper a função e a atividade desempenhadas pelas proteínas. É importante observar que os metais pesados ​​se enquadram em categorias que consistem em metais de transição, bem como em uma quantidade selecionada de metalóide. Esses metais, ao interagir com proteínas nativas dobradas, tendem a desempenhar um papel na obstrução de sua atividade biológica. Essa interferência pode ser realizada de várias maneiras diferentes. Esses metais pesados ​​podem formar um complexo com os grupos funcionais da cadeia lateral presentes em uma proteína ou formar ligações com tióis livres. Os metais pesados ​​também desempenham um papel na oxidação das cadeias laterais de aminoácidos presentes nas proteínas. Junto com isso, ao interagir com metaloproteínas, os metais pesados ​​podem deslocar e substituir os principais íons metálicos. Como resultado, os metais pesados ​​podem interferir nas proteínas dobradas, o que pode deter fortemente a estabilidade e a atividade das proteínas.

    Reversibilidade e irreversibilidade

    Em muitos casos, a desnaturação é reversível (as proteínas podem recuperar seu estado nativo quando a influência desnaturante é removida). Este processo pode ser denominado renaturação. Esse entendimento levou à noção de que todas as informações necessárias para que as proteínas assumissem seu estado nativo estavam codificadas na estrutura primária da proteína e, portanto, no DNA que codifica a proteína, a chamada " hipótese termodinâmica do Anfinsen ".

    A desnaturação também pode ser irreversível. Esta irreversibilidade é tipicamente uma irreversibilidade cinética, não termodinâmica, visto que uma proteína dobrada geralmente tem menos energia livre do que quando é desdobrada. Por meio da irreversibilidade cinética, o fato de a proteína estar presa em um mínimo local pode impedi-la de se dobrar novamente após ter sido irreversivelmente desnaturada.

    Desnaturação de proteínas devido ao pH

    A desnaturação também pode ser causada por mudanças no pH que podem afetar a química dos aminoácidos e seus resíduos. Os grupos ionizáveis ​​em aminoácidos são capazes de se tornar ionizados quando ocorrem mudanças no pH. Uma mudança de pH para condições mais ácidas ou básicas pode induzir o desdobramento. O desdobramento induzido por ácido freqüentemente ocorre entre pH 2 e 5, o desdobramento induzido por base geralmente requer pH 10 ou superior.

    Desnaturação de ácido nucléico

    Artigo principal: Termodinâmica do ácido nucléico

    Os ácidos nucléicos (incluindo RNA e DNA ) são polímeros de nucleotídeos sintetizados por enzimas polimerase durante a transcrição ou replicação do DNA . Após a síntese 5'-3 'da estrutura, as bases nitrogenadas individuais são capazes de interagir umas com as outras por meio de ligações de hidrogênio , permitindo assim a formação de estruturas de ordem superior. A desnaturação do ácido nucleico ocorre quando a ligação de hidrogênio entre os nucleotídeos é interrompida e resulta na separação das fitas previamente recozidas . Por exemplo, a desnaturação do DNA devido a altas temperaturas resulta na ruptura dos pares de bases de Watson e Crick e na separação da hélice de fita dupla em duas fitas simples. As fitas de ácido nucléico são capazes de recozer novamente quando as condições " normais " são restauradas, mas se a restauração ocorrer muito rapidamente, as fitas de ácido nucléico podem recozer de forma imperfeita, resultando no emparelhamento impróprio de bases.

    Desnaturação induzida biologicamente

    A desnaturação do DNA ocorre quando as ligações de hidrogênio entre os pares de bases Watson e Crick são perturbadas.

    As interações não covalentes entre fitas antiparalelas no DNA podem ser quebradas a fim de "abrir" a dupla hélice quando mecanismos biologicamente importantes, como replicação de DNA, transcrição, reparo de DNA ou ligação de proteína são definidos para ocorrer. A área de DNA parcialmente separada é conhecida como bolha de desnaturação, que pode ser definida mais especificamente como a abertura de uma dupla hélice de DNA por meio da separação coordenada de pares de bases.

    O primeiro modelo que tentou descrever a termodinâmica da bolha de desnaturação foi introduzido em 1966 e chamado de Modelo Poland-Scheraga. Este modelo descreve a desnaturação das fitas de DNA em função da temperatura . À medida que a temperatura aumenta, as ligações de hidrogênio entre os pares de bases de Watson e Crick são cada vez mais perturbadas e "loops desnaturados" começam a se formar. No entanto, o modelo Poland-Scheraga agora é considerado elementar porque falha em levar em conta as implicações confusas da sequência do DNA , composição química, rigidez e torção .

    Estudos termodinâmicos recentes inferiram que o tempo de vida de uma bolha de desnaturação singular varia de 1 microssegundo a 1 milissegundo. Esta informação é baseada em escalas de tempo estabelecidas de replicação e transcrição do DNA. Atualmente, estudos de pesquisa biofísica e bioquímica estão sendo realizados para elucidar mais completamente os detalhes termodinâmicos da bolha de desnaturação.

    Desnaturação devido a agentes químicos

    A formamida desnatura o DNA ao romper as ligações de hidrogênio entre os pares de bases Watson e Crick. As linhas laranja, azul, verde e roxa representam adenina, timina, guanina e citosina, respectivamente. As três linhas pretas curtas entre as bases e as moléculas de formamida representam ligações de hidrogênio recém-formadas.

    Com a reação em cadeia da polimerase (PCR) sendo um dos contextos mais populares nos quais a desnaturação do DNA é desejada, o aquecimento é o método mais frequente de desnaturação. Além da desnaturação por calor, os ácidos nucleicos podem sofrer o processo de desnaturação por meio de vários agentes químicos, como formamida , guanidina , salicilato de sódio , dimetilsulfóxido (DMSO), propilenoglicol e ureia . Esses agentes químicos desnaturantes reduzem a temperatura de fusão ( Tm ) competindo por doadores e aceitadores de ligações de hidrogênio com pares de bases nitrogenadas pré-existentes . Alguns agentes são mesmo capazes de induzir a desnaturação à temperatura ambiente. Por exemplo, agentes alcalinos (por exemplo, NaOH) mostraram desnaturar o DNA ao alterar o pH e remover prótons que contribuem com ligações de hidrogênio. Esses desnaturantes têm sido empregados para fazer gel de Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE), que promove a desnaturação de ácidos nucléicos para eliminar a influência da forma do ácido nucléico em sua mobilidade eletroforética .

    Desnaturação química como alternativa

    A atividade óptica (absorção e espalhamento de luz) e propriedades hidrodinâmicas ( difusão translacional , coeficientes de sedimentação e tempos de correlação rotacional ) de ácidos nucléicos desnaturados com formamida são semelhantes às dos ácidos nucléicos desnaturados por calor. Portanto, dependendo do efeito desejado, a desnaturação química do DNA pode fornecer um procedimento mais suave para a desnaturação de ácidos nucleicos do que a desnaturação induzida pelo calor. Estudos comparando diferentes métodos de desnaturação, como aquecimento, moinho de grânulos de diferentes tamanhos de grânulos, sonificação de sonda e desnaturação química mostram que a desnaturação química pode fornecer desnaturação mais rápida em comparação com os outros métodos de desnaturação física descritos. Particularmente nos casos em que a renaturação rápida é desejada, os agentes químicos de desnaturação podem fornecer uma alternativa ideal ao aquecimento. Por exemplo, fitas de DNA desnaturadas com agentes alcalinos , como NaOH, renaturam assim que o tampão de fosfato é adicionado.

    Desnaturação devido ao ar

    Moléculas pequenas e eletronegativas , como nitrogênio e oxigênio , que são os gases primários do ar , têm um impacto significativo na capacidade das moléculas circundantes de participar das ligações de hidrogênio . Essas moléculas competem com os aceitadores de ligações de hidrogênio em volta dos doadores de ligações de hidrogênio, agindo, portanto, como "quebradores de ligações de hidrogênio" e enfraquecendo as interações entre as moléculas circundantes no ambiente. As fitas antiparelulares nas hélices duplas do DNA são ligadas de forma não covalente por ligações de hidrogênio entre os pares de bases Watson e Crick; nitrogênio e oxigênio, portanto, mantêm o potencial de enfraquecer a integridade do DNA quando exposto ao ar. Como resultado, os filamentos de DNA expostos ao ar requerem menos força para separar e exemplificar temperaturas de fusão mais baixas .

    Formulários

    Muitas técnicas de laboratório dependem da capacidade das fitas de ácido nucléico se separarem. Compreendendo as propriedades de desnaturação de ácido nucleico, os seguintes métodos foram criados:

    Desnaturantes

    Desnaturantes de proteínas

    Ácidos

    Os desnaturantes de proteínas ácidas incluem:

    Bases

    As bases funcionam de forma semelhante aos ácidos na desnaturação. Eles incluem:

    Solventes

    A maioria dos solventes orgânicos são desnaturantes, incluindo:

    Reagentes de reticulação

    Os agentes de reticulação para proteínas incluem:

    Agentes caotrópicos

    Os agentes caotrópicos incluem:

    Redutores de ligação dissulfeto

    Os agentes que quebram as ligações dissulfeto por redução incluem:

    Agentes quimicamente reativos

    Agentes como peróxido de hidrogênio, cloro elementar, ácido hipocloroso (água com cloro), bromo, água de bromo, iodo, ácidos nítrico e oxidante e ozônio reagem com frações sensíveis, como sulfeto / tiol, anéis aromáticos ativados (fenilalanina) com efeito danificam o proteína e torná-la inútil.

    De outros

    Desnaturantes de ácido nucléico

    Químico

    Os desnaturantes de ácido nucleico ácidos incluem:

    Os desnaturantes de ácido nucleico básicos incluem:

    • NaOH

    Outros desnaturantes de ácido nucleico incluem:

    Fisica

    Veja também

    Referências

    links externos