Microscopia holográfica digital - Digital holographic microscopy

Gravura química medida em tempo real
Figura 1. Imagem de deslocamento de fase DHM dos detalhes da célula.
Medição de acabamento de superfície

A microscopia holográfica digital ( DHM ) é a holografia digital aplicada à microscopia . A microscopia holográfica digital se distingue de outros métodos de microscopia por não registrar a imagem projetada do objeto. Em vez disso, a informação da frente da onda de luz originada do objeto é gravada digitalmente como um holograma , a partir do qual um computador calcula a imagem do objeto usando um algoritmo de reconstrução numérico . A lente formadora de imagem na microscopia tradicional é então substituída por um algoritmo de computador. Outros métodos de microscopia intimamente relacionados à microscopia holográfica digital são microscopia interferométrica , tomografia de coerência óptica e microscopia de fase de difração. Comum a todos os métodos é o uso de uma frente de onda de referência para obter informações de amplitude (intensidade) e fase . A informação é gravada em um sensor de imagem digital ou por um fotodetector a partir do qual uma imagem do objeto é criada (reconstruída) por um computador. Na microscopia tradicional, que não usa uma frente de onda de referência, apenas as informações de intensidade são registradas e as informações essenciais sobre o objeto são perdidas.

A holografia foi inventada por Dennis Gabor para melhorar a microscopia eletrônica . No entanto, nunca encontrou muitas aplicações concretas e industriais neste campo.

Na verdade, o DHM tem sido aplicado principalmente à microscopia de luz. Neste campo, tem mostrado aplicações únicas para caracterização 3D de amostras técnicas e permite a caracterização quantitativa de células vivas. Na ciência dos materiais , o DHM é rotineiramente usado para pesquisas em laboratórios acadêmicos e industriais. Dependendo da aplicação, os microscópios podem ser configurados para propósitos de transmissão e reflexão. DHM é uma solução única para caracterização 4D (3D + tempo) de amostras técnicas, quando as informações precisam ser adquiridas em um curto intervalo de tempo. É o caso de medições em ambientes ruidosos, na presença de vibrações, quando as amostras se movem, ou quando a forma das amostras muda devido a estímulos externos, como forças mecânicas, elétricas ou magnéticas, erosão química ou deposição e evaporação. Em ciências da vida, o DHM geralmente é configurado no modo de transmissão. Isso permite a medição de fase quantitativa sem rótulo (QPM), também chamada de imagem de fase quantitativa (QPI), de células vivas. As medições não afetam as células, possibilitando estudos de longo prazo. Ele fornece informações que podem ser interpretadas em muitos processos biológicos subjacentes, conforme explicado na seção " Imagens de células vivas " abaixo.

Princípio de trabalho

Figura 2. Configuração óptica típica de DHM.

Para criar o padrão de interferência necessário , ou seja, o holograma, a iluminação precisa ser uma fonte de luz coerente (monocromática), um laser, por exemplo. Como pode ser visto na Figura 2, a luz laser é dividida em um feixe de objeto e um feixe de referência. O feixe de objeto expandido ilumina a amostra para criar a frente de onda do objeto. Depois que a frente de onda do objeto é coletada por uma objetiva de microscópio , as frentes de onda do objeto e de referência são unidas por um divisor de feixe para interferir e criar o holograma. Usando o holograma gravado digitalmente, um computador atua como uma lente digital e calcula uma imagem visível da frente de onda do objeto usando um algoritmo de reconstrução numérica.

Normalmente, uma objetiva de microscópio é usada para coletar a frente de onda do objeto. No entanto, como a objetiva do microscópio é usada apenas para coletar luz e não para formar uma imagem, ela pode ser substituída por uma lente simples. Se uma resolução óptica ligeiramente inferior for aceitável, a objetiva do microscópio pode ser totalmente removida.

A holografia digital vem em diferentes sabores, como Fresnel fora do eixo , Fourier , plano de imagem , in-line , Gabor e holografia digital de deslocamento de fase , dependendo da configuração óptica. O princípio básico, entretanto, é o mesmo; um holograma é gravado e uma imagem é reconstruída por um computador.

A resolução óptica lateral da microscopia holográfica digital é equivalente à resolução da microscopia de luz tradicional . O DHM é limitado pela difração pela abertura numérica , da mesma forma que a microscopia de luz tradicional. No entanto, o DHM oferece uma excelente resolução axial (profundidade). Foi relatada uma precisão axial de aproximadamente 5 nm.

Vantagens

Figura 3. Comparação de uma imagem de deslocamento de fase DHM (esquerda) e uma imagem de microscopia de contraste de fase (direita).

Imagens de deslocamento de fase
Além da imagem de campo claro comum , uma imagem de deslocamento de fase também é criada. A imagem de deslocamento de fase é exclusiva para microscopia holográfica digital e fornece informações quantificáveis ​​sobre a distância óptica . No DHM de reflexão, a imagem de deslocamento de fase forma uma imagem topográfica do objeto.

Objetos transparentes, como células biológicas vivas , são tradicionalmente vistos em um microscópio de contraste de fase ou em um microscópio de contraste de interferência diferencial . Esses métodos visualizam objetos transparentes de mudança de fase, distorcendo a imagem do campo claro com informações de mudança de fase. Em vez de distorcer a imagem do campo claro, a transmissão DHM cria uma imagem de deslocamento de fase separada mostrando a espessura óptica do objeto. A microscopia holográfica digital, portanto, torna possível visualizar e quantificar objetos transparentes e, portanto, também é conhecida como microscopia de contraste de fase quantitativa .

As imagens tradicionais de contraste de fase ou de campo claro de células biológicas vivas não coradas, Figura 3 (direita), provaram ser muito difíceis de analisar com software de análise de imagem . Ao contrário, as imagens de deslocamento de fase, Figura 3 (esquerda), são prontamente segmentadas e analisadas por software de análise de imagem baseado em morfologia matemática , como CellProfiler .

Informações tridimensionais
Uma imagem de objeto é calculada a uma determinada distância focal . No entanto, como o holograma gravado contém todas as informações necessárias da frente da onda do objeto, é possível calcular o objeto em qualquer plano focal alterando o parâmetro de distância focal no algoritmo de reconstrução. Na verdade, o holograma contém todas as informações necessárias para calcular uma pilha completa de imagens . Em um sistema DHM, onde a frente de onda do objeto é registrada de vários ângulos, é possível caracterizar completamente as características ópticas do objeto e criar imagens tomográficas do objeto.

Digital autofocus
convencional de focagem automática é conseguida por verticalmente alterar a distância focal até um plano de imagem focado é encontrado. Como a pilha completa de planos de imagem pode ser calculada a partir de um único holograma, é possível usar qualquer método de foco automático passivo para selecionar digitalmente o plano focal. Os recursos de foco automático digital da holografia digital abrem a possibilidade de digitalizar e imagens de superfícies de forma extremamente rápida, sem qualquer movimento mecânico vertical. Ao gravar um único holograma e posteriormente costurar subimagens que são calculadas em diferentes planos focais, uma imagem completa e focada do objeto pode ser criada.

Correção de aberração óptica
Como os sistemas DHM não têm lentes formadoras de imagem, as aberrações ópticas tradicionais não se aplicam a DHM. As aberrações ópticas são "corrigidas" pelo projeto do algoritmo de reconstrução. Um algoritmo de reconstrução que modela verdadeiramente a configuração óptica não sofrerá aberrações ópticas.

Baixo custo
Em sistemas de microscopia óptica , as aberrações ópticas são tradicionalmente corrigidas pela combinação de lentes em uma objetiva de microscópio de formação de imagem complexa e cara. Além disso, a profundidade focal estreita em grandes ampliações requer uma mecânica de precisão. Os componentes necessários para um sistema DHM são componentes ópticos e semicondutores baratos, como um diodo laser e um sensor de imagem . O baixo custo dos componentes, em combinação com os recursos de foco automático do DHM, tornam possível fabricar sistemas DHM por um custo muito baixo.

Formulários

Figura 4. Imagem de deslocamento de fase DHM de glóbulos vermelhos humanos .

A microscopia holográfica digital tem sido aplicada com sucesso em uma variedade de áreas de aplicação.

Imagens de células vivas

No entanto, devido à capacidade do DHM de visualizar e quantificar o tecido biológico de forma não invasiva, as aplicações biomédicas têm recebido mais atenção. Exemplos de aplicações biomédicas são:

  • Contagem de células sem rótulo em culturas de células aderentes . A microscopia holográfica digital torna possível realizar a contagem de células e medir a viabilidade celular diretamente na câmara de cultura de células. Hoje, os métodos de contagem de células mais usados, hemocitômetro ou contador Coulter , só funcionam com células em suspensão.
  • Análise de viabilidade sem rótulo de culturas de células aderentes. A holografia digital tem sido usada para estudar o processo apoptótico em diferentes tipos de células. As alterações do índice de refração que ocorrem durante o processo apoptótico são facilmente medidas com DHM.
  • Análise do ciclo celular sem rótulo . Foi demonstrado que a mudança de fase induzida pelas células está correlacionada à massa seca da célula. A massa seca celular pode ser combinada com outros parâmetros obtidos por holografia digital, como volume celular e índice de refração, para fornecer uma melhor compreensão do ciclo celular.
  • Análise da morfologia sem rótulo de células. A holografia digital tem sido usada em diferentes contextos para estudar a morfologia celular sem coloração nem rotulagem. Isso pode ser usado para acompanhar processos como o processo de diferenciação em que as características das células mudam. O DHM também tem sido usado para monitoramento automatizado de células-tronco vegetais e tornou possível distinguir entre dois tipos de células-tronco medindo parâmetros morfológicos.
  • Marque estudos de células nervosas livres . A microscopia holográfica digital torna possível estudar processos não perturbados nas células nervosas, uma vez que nenhuma marcação é necessária. O inchaço e a mudança de forma das células nervosas causadas pelo desequilíbrio celular foram facilmente estudados.
Figura 5. Lapso de tempo de células não coradas, em divisão e em migração.
  • Análise de alto conteúdo sem rótulo . A análise / seleção de alto conteúdo fluorescente tem várias desvantagens. Alternativas livres de rótulos com base em imagens de deslocamento de fase foram, portanto, propostas. A capacidade do DHM de obter imagens de deslocamento de fase rapidamente em grandes áreas abre novas possibilidades de caracterização quantitativa muito rápida do ciclo celular e dos efeitos de agentes farmacológicos específicos.
  • Análise de glóbulos vermelhos . Imagens de mudança de fase têm sido usadas para estudar a dinâmica dos glóbulos vermelhos. O volume de glóbulos vermelhos e a concentração de hemoglobina foram medidos combinando informações de imagens de absorção e mudança de fase para facilitar a contagem completa de glóbulos por microscopia holográfica. Além disso, foi demonstrado que a informação da mudança de fase discrimina os glóbulos vermelhos imaturos dos maduros, facilitando acontagem de reticulócitos não corados .
  • Citometria de fluxo e rastreamento e caracterização de partículas. As imagens criadas por holografia digital são calculadas a partir do holograma gravado a qualquer momento após a gravação real e em qualquer plano focal determinado. Combinando várias imagens calculadas a partir do mesmo holograma, mas em planos focais diferentes, uma maior profundidade de campo pode ser obtida, que é muito superior ao que pode ser alcançado com a microscopia de luz tradicional. O aumento da profundidade de campo torna possível obter imagens e caracterizar a morfologia de células e partículas em suspensão. As observações podem ser feitas diretamente em umcanal microfluídico ou estaticamente em uma câmara de observação.
  • Microscopia de lapso de tempo da divisão e migração celular. Os recursos de imagem de foco automático e deslocamento de fase da microscopia holográfica digital possibilitam a criação sem esforço devideoclipes com lapso de tempo quantificáveis ​​e livres de rótulosde células não coradas paraestudos de migração celular . Na Figura 5, é mostrado um lapso de tempo sem rótulo de células em divisão e migração.
  • Estudos de tomografia . A microscopia holográfica digital permite a análise sem marcadores e quantificável do movimento subcelular nas profundezas do tecido vivo.

Topografia 3D de superfície

DHM realiza medições estáticas de topografia de superfície 3D como muitos outros profilômetros ópticos 3D (interferômetros de luz branca, confocal, variação de foco, ...). Permite recuperar a rugosidade e a forma de muitas superfícies. O uso de vários comprimentos de onda permite superar o limite de 1/4 dos interferômetros de deslocamento de fase tradicionais. As aplicações foram demonstradas em muitas amostras, como implantes médicos, componentes de relógios, micro componentes, micro-ópticas.

Aplicativos resolvidos com tempo

Superfície de autocura se recuperando de um arranhão: medição em tempo real

Como o DHM mede a topografia da superfície 3D em todo o campo de visão em uma única aquisição de câmera, não há necessidade de digitalização, nem vertical, nem lateral. Consequentemente, as mudanças dinâmicas da topografia são medidas instantaneamente. A taxa de aquisição é limitada apenas pelo quadro da câmera. As medições foram demonstradas em muitos tipos de amostras, como superfície inteligente, superfícies de autocura, sistemas sem equilíbrio, processos de evaporação, eletrodeposição, evaporação, cristalização, deformação mecânica, etc.

MEMS

Transdutores ultrassônicos medidos a 8 MHz no modo estroboscópico

Usado em conjunto com uma unidade eletrônica estroboscópica para sincronizar o pulso do laser para a iluminação da amostra e a aquisição da câmera com a excitação MEMS, o DHM® fornece sequências de tempo de topografia 3D ao longo da fase de excitação dos microssistemas. A análise desta sequência de tempo de topografias 3D adquiridas em uma frequência fixa fornece um mapa de vibração e permite a decomposição do movimento em termos de dentro e fora do plano.

A varredura da frequência de excitação fornece ressonâncias estruturais, bem como análise de Bode de amplitude e fase. A medição foi demonstrada em muitos tipos de MEMS, como atuadores de acionamento de pente, micro-espelhos, acelerômetros, giroscópios, microbombas, microfones, transdutores ultrassônicos, cantiléveres e ondas acústicas de superfície, entre outros.

Metrologia

DHM se refere apenas a comprimentos de onda para medição de altura. Portanto, o DHM fornece medições precisas de altura com altíssima repetibilidade e linearidade, independentemente de qualquer calibração vertical, posicionamento preciso da parte mecânica, repetibilidade do piezo-controlador interferométrico, deslocamento motorizado ou varredura de tela de cristal líquido. Este recurso faz do DHM uma excelente ferramenta para certificação de degraus e rugosidade, entre outras. Para sistemas de transmissão, a calibração de planicidade perfeita é alcançada tomando como referência uma aquisição sem nenhuma amostra no caminho óptico. A calibração de planicidade de sistemas de tipo de reflexão requer o uso de uma amostra perfeitamente plana.

Inspeção industrial

Medição automática de prótese de quadril: caracterização da rugosidade da superfície

O curto tempo necessário para obter informações torna o DHM muito robusto às vibrações ambientais. Ele permite, em particular, controles de qualidade “em vôo” e “on-line” das peças. Aplicações foram demonstradas em particular para rugosidade de implantes, estrutura de componentes semicondutores, indústria solar, metrologia industrial e peças de relógios, entre outros.

Micro ótica

Medição e inspeção rápidas de matrizes de micro-óptica foram demonstradas e comparadas com sucesso com medições feitas com outros profilômetros.

A profundidade estendida de algoritmos de foco com base na focalização digital permite ter um foco nítido sobre toda a superfície da lente, mesmo para amostras de alto NA. DHM também foi aplicado à caracterização dinâmica de lentes variáveis.

Rastreamento de partículas 3D

O rastreamento de partículas 3D foi demonstrado em várias publicações [a ser completado]. Uma pilha Z de medição pode ser reconstruída digitalmente a partir de um único holograma usando uma faixa de distâncias de propagação. Algoritmos específicos permitem determinar para cada partícula a distância correspondente ao seu melhor foco. Executar esta operação em uma seqüência de tempo de hologramas permite determinar as trajetórias das partículas.

História

Os primeiros relatórios de substituição do holograma fotográfico da holografia clássica pelo registro digital do holograma e pela reconstrução numérica da imagem em um computador foram publicados no final dos anos 1960 e no início dos anos 1970. Idéias semelhantes foram propostas para o microscópio eletrônico no início dos anos 1980. Mas, os computadores eram muito lentos e os recursos de gravação eram muito pobres para que a holografia digital fosse útil na prática. Após a empolgação inicial, a holografia digital entrou em uma hibernação semelhante à que a holografia havia experimentado cerca de duas décadas antes. (Observe que na década de 1960, "holografia digital" poderia significar computar uma imagem de um holograma ou computar um holograma de um modelo 3D. Este último se desenvolveu em paralelo com a holografia clássica durante o hiato, e durante esse tempo, "digital holografia "era sinônimo do que agora é conhecido como holografia gerada por computador .)

Em meados da década de 1990, sensores de imagem digital e computadores tornaram-se poderosos o suficiente para reconstruir imagens com alguma qualidade, mas ainda não tinham a contagem de pixels e densidade necessárias para que a holografia digital fosse algo mais do que uma curiosidade. Na época, o mercado que impulsionava os sensores de imagem digital era principalmente o vídeo de baixa resolução e, portanto, esses sensores forneciam apenas resolução PAL , NTSC ou SECAM . Isso mudou repentinamente no início do século 21 com a introdução de câmeras digitais de imagem estática , que impulsionou a demanda por sensores de alta contagem de pixels de baixo custo. Em 2010, sensores de imagem acessíveis podem ter até 60 megapixels. Além disso, o mercado de leitores de CD e DVD impulsionou o desenvolvimento de óticas e lasers de diodo a preços acessíveis .

Os primeiros relatos do uso da holografia digital para microscopia de luz surgiram em meados da década de 1990. No entanto, foi somente no início dos anos 2000 que a tecnologia do sensor de imagem progrediu o suficiente para permitir imagens de qualidade razoável. Durante esse tempo, as primeiras empresas comerciais de microscopia holográfica digital foram fundadas. Com maior poder de computação e uso de sensores e lasers de alta resolução de baixo custo, a microscopia holográfica digital está hoje encontrando aplicações principalmente nas ciências da vida, oceanologia e metrologia .

Veja também

Referências

links externos

Leitura adicional

Livros

  • Métodos de holografia digital de LP Yaroslavskii e NS Merzlyakov, Springer (1980)
  • Holografia digital e processamento digital de imagens: princípios, métodos, algoritmos de Leonid Yaroslavsky, Kluwer (2004)
  • Manual de interferometria holográfica: métodos ópticos e digitais de Thomas Kreis, Wiley (2004)
  • Holografia digital por U. Schnars e W. Jueptner, Springer (2005)
  • Holografia digital e exibição tridimensional: princípios e aplicações por Ting-Chung Poon (Editor), Springer (2006)
  • Aplicações de Holografia Digital e Microscopia: Análise Tridimensional de Objetos e Rastreamento por Cedric Schockaert, VDM Verlag (2009)
  • Microscopia Holográfica de Objetos Microscópicos de Fase: Teoria e Prática de Tatyana Tishko, Tishko Dmitry, Titar Vladimir, World Scientific (2010)
  • Quantitative Phase Imaging of Cells and Tissues por Gabriel Popescu, McGraw-Hill (2011)
  • Microscopia Holográfica Digital: Princípios, Técnicas e Aplicações de Myung K. Kim, Springer (2011)
  • Microscopia de luz coerente: imagem e análise de fase quantitativa editada por Pietro Ferraro, Springer (2011)
  • Holografia digital para MEMS e metrologia de microsistema editada por Erdal Cayirci, Wiley (2011)
  • Processamento de imagem para holografia digital por Karen Molony, VDM Verlag (2011)
  • Holografia digital de Pascal Picart e Jun-chang Li, Wiley (2012)

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