Eco RV - EcoRV

Sequência de reconhecimento de DNA de EcoRV. A linha verde representa o local de corte.
EcoRV clivando DNA. A proteína se liga fracamente ao DNA e procura sua sequência de reconhecimento. Uma vez encontrado, o EcoRV torce o DNA em um ângulo de 50 ° e cliva na sequência cognata.
Endonuclease de restrição EcoRV
EcoRV Crystal Structure.rsh.png
Estrutura de cristal EcoRV complexada com DNA de fita dupla
Identificadores
Símbolo Endonuc-EcoRV
Pfam PF09233
InterPro IPR015314
SCOP2 1sx5 / SCOPe / SUPFAM

Eco RV (pronuncia-se "eco R five") é uma endonuclease de restrição do tipo IIisolada de certas cepas de Escherichia coli . Possui o nome alternativo Eco32I.

Em biologia molecular , é uma enzima de restrição comumente usada . Isso cria pontas cegas . A enzima reconhece a sequência de DNA palindrômica de 6 bases 5'-GAT | ATC-3 'e apresenta uma extremidade cega na linha vertical.

The complementary sequence is then 3'-CTA|TAG-5'. The ends are blunt and can be ligated into a blunt cloning site easily but with lower efficiency than sticky ends.

Estrutura

A estrutura desta enzima, e de vários mutantes, em complexo com a sequência de DNA que ela corta foi resolvida por cristalografia de raios-X .

O núcleo da enzima consiste em uma folha β mista de cinco fitas flanqueada por hélices α. O núcleo é conservado em todas as outras endonucleases de restrição do tipo II. Ele também tem um subdomínio de dimerização N-terminal formado por uma α-hélice curta, uma folha antiparalela de duas fitas e uma α-hélice longa. Este subdomínio é encontrado apenas em EcoRV e PvuII.

Modo de ação

Como EcoRI , EcoRV forma um homodímero em solução antes de se ligar e agir em sua sequência de reconhecimento . Inicialmente, a enzima se liga fracamente a um local não específico do DNA. Ele caminha aleatoriamente ao longo da molécula até que o local de reconhecimento específico seja encontrado. EcoRV tem uma alta especificidade para sua sequência de DNA alvo.

A ligação da enzima induz uma mudança conformacional no DNA, dobrando-o em cerca de 50 °. A dobra do DNA resulta no desempilhamento das bases, alargamento do sulco menor e compressão do sulco principal. Isso faz com que a ligação do fosfodiéster seja quebrada mais perto do sítio ativo da enzima, onde pode ser clivada. A clivagem ocorre dentro da sequência de reconhecimento e não requer hidrólise de ATP.

EcoRV é a única endonuclease de restrição do tipo II conhecida por causar uma importante alteração conformacional induzida por proteína no DNA.

Usos

EcoRV é freqüentemente usado para abrir um vetor de plasmídeo para inserir um gene de interesse durante a clonagem do gene . A enzima é fornecida por muitos fabricantes e requer albumina de soro bovino para funcionar corretamente.

Veja também

  • EcoRI , outra enzima nuclease de E. coli .
  • EcoRII , outra enzima nuclease de E. coli .
  • FokI , uma enzima nuclease de Flavobacterium okeanokoites

Referências