Eco RV - EcoRV
Endonuclease de restrição EcoRV | |||||||||
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Identificadores | |||||||||
Símbolo | Endonuc-EcoRV | ||||||||
Pfam | PF09233 | ||||||||
InterPro | IPR015314 | ||||||||
SCOP2 | 1sx5 / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
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Eco RV (pronuncia-se "eco R five") é uma endonuclease de restrição do tipo IIisolada de certas cepas de Escherichia coli . Possui o nome alternativo Eco32I.
Em biologia molecular , é uma enzima de restrição comumente usada . Isso cria pontas cegas . A enzima reconhece a sequência de DNA palindrômica de 6 bases 5'-GAT | ATC-3 'e apresenta uma extremidade cega na linha vertical.
The complementary sequence is then 3'-CTA|TAG-5'. The ends are blunt and can be ligated into a blunt cloning site easily but with lower efficiency than sticky ends.
Estrutura
A estrutura desta enzima, e de vários mutantes, em complexo com a sequência de DNA que ela corta foi resolvida por cristalografia de raios-X .
O núcleo da enzima consiste em uma folha β mista de cinco fitas flanqueada por hélices α. O núcleo é conservado em todas as outras endonucleases de restrição do tipo II. Ele também tem um subdomínio de dimerização N-terminal formado por uma α-hélice curta, uma folha antiparalela de duas fitas e uma α-hélice longa. Este subdomínio é encontrado apenas em EcoRV e PvuII.
Modo de ação
Como EcoRI , EcoRV forma um homodímero em solução antes de se ligar e agir em sua sequência de reconhecimento . Inicialmente, a enzima se liga fracamente a um local não específico do DNA. Ele caminha aleatoriamente ao longo da molécula até que o local de reconhecimento específico seja encontrado. EcoRV tem uma alta especificidade para sua sequência de DNA alvo.
A ligação da enzima induz uma mudança conformacional no DNA, dobrando-o em cerca de 50 °. A dobra do DNA resulta no desempilhamento das bases, alargamento do sulco menor e compressão do sulco principal. Isso faz com que a ligação do fosfodiéster seja quebrada mais perto do sítio ativo da enzima, onde pode ser clivada. A clivagem ocorre dentro da sequência de reconhecimento e não requer hidrólise de ATP.
EcoRV é a única endonuclease de restrição do tipo II conhecida por causar uma importante alteração conformacional induzida por proteína no DNA.
Usos
EcoRV é freqüentemente usado para abrir um vetor de plasmídeo para inserir um gene de interesse durante a clonagem do gene . A enzima é fornecida por muitos fabricantes e requer albumina de soro bovino para funcionar corretamente.
Veja também
- EcoRI , outra enzima nuclease de E. coli .
- EcoRII , outra enzima nuclease de E. coli .
- FokI , uma enzima nuclease de Flavobacterium okeanokoites