Célula-tronco embrionária - Embryonic stem cell

Células-tronco embrionárias humanas em cultura de células
Pluripotente: as células-tronco embrionárias podem se desenvolver em qualquer tipo de célula, exceto as da placenta. Apenas as células-tronco embrionárias da mórula são totipotentes : capazes de se desenvolver em qualquer tipo de célula, inclusive as da placenta.

As células-tronco embrionárias ( células ES ou ESCs ) são células- tronco pluripotentes derivadas da massa celular interna de um blastocisto , um embrião em estágio inicial de pré- implantação . Os embriões humanos atingem o estágio de blastocisto 4-5 dias após a fertilização , momento em que consistem em 50-150 células. Isolar o embrioblasto , ou massa celular interna (ICM) resulta na destruição do blastocisto, um processo que levanta questões éticas , incluindo se os embriões na fase de pré-implantação têm ou não as mesmas considerações morais que os embriões na fase de pós-implantação de desenvolvimento.

Atualmente, os pesquisadores estão se concentrando fortemente no potencial terapêutico das células-tronco embrionárias, com o uso clínico sendo o objetivo de muitos laboratórios. Os usos potenciais incluem o tratamento de diabetes e doenças cardíacas . As células estão sendo estudadas para serem usadas como terapias clínicas, modelos de distúrbios genéticos e reparo celular / DNA. No entanto, efeitos adversos na pesquisa e processos clínicos, como tumores e respostas imunológicas indesejadas , também foram relatados.

Propriedades

O transcriptoma de células-tronco embrionárias

As células-tronco embrionárias (ESCs), derivadas do estágio de blastocisto de embriões de mamíferos iniciais, são diferenciadas por sua capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula embrionária e por sua capacidade de se auto-renovar. São essas características que os tornam valiosos nos campos científico e médico. As ESCs têm um cariótipo normal , mantêm alta atividade da telomerase e exibem notável potencial proliferativo de longo prazo .

Pluripotente

As células-tronco embrionárias da massa celular interna são pluripotentes , o que significa que são capazes de se diferenciar para gerar ectoderme primitivo, que em última análise se diferencia durante a gastrulação em todos os derivados das três camadas germinativas primárias : ectoderme , endoderme e mesoderma . Essas camadas germinativas geram cada um dos mais de 220 tipos de células no corpo humano adulto. Quando fornecidos com os sinais apropriados, os ESCs inicialmente formam células precursoras que posteriormente se diferenciam nos tipos de células desejados. A pluripotência distingue as células-tronco embrionárias das células- tronco adultas , que são multipotentes e só podem produzir um número limitado de tipos de células.

Auto-renovação e reparo de estrutura

Sob condições definidas, as células-tronco embrionárias são capazes de se auto-renovar indefinidamente em um estado indiferenciado. As condições de autorrenovação devem impedir que as células se aglutinem e manter um ambiente que suporte um estado não especializado. Normalmente, isso é feito em laboratório com mídia contendo soro e fator inibidor de leucemia ou suplementos de mídia sem soro com duas drogas inibitórias ("2i"), o inibidor de MEK PD03259010 e o inibidor de GSK-3 CHIR99021.

Crescimento

As ESCs se dividem com muita frequência devido a uma fase G1 encurtada em seu ciclo celular . A divisão celular rápida permite que as células cresçam rapidamente em número, mas não em tamanho, o que é importante para o desenvolvimento embrionário inicial. Em ESCs, as proteínas ciclina A e ciclina E envolvidas na transição G1 / S são sempre expressas em níveis elevados. As quinases dependentes de ciclina , como CDK2, que promovem a progressão do ciclo celular, são hiperativas, em parte devido à regulação negativa de seus inibidores. As proteínas do retinoblastoma que inibem o fator de transcrição E2F até que a célula esteja pronta para entrar na fase S são hiperfosforiladas e inativadas nas ESCs, levando à expressão contínua de genes de proliferação. Essas mudanças resultam em ciclos acelerados de divisão celular. Embora altos níveis de expressão de proteínas pró-proliferativas e uma fase G1 encurtada tenham sido associados à manutenção da pluripotência, os ESCs crescidos em condições 2i sem soro expressam proteínas retinoblastoma ativas hipo-fosforiladas e têm uma fase G1 alongada. Apesar dessa diferença no ciclo celular quando comparadas às ESCs cultivadas em meio contendo soro, essas células apresentam características pluripotentes semelhantes. Fatores de pluripotência Oct4 e Nanog desempenham um papel na regulação transcricional do ciclo celular ESC.

Usos

Devido à sua plasticidade e capacidade potencialmente ilimitada de autorrenovação, terapias com células- tronco embrionárias têm sido propostas para a medicina regenerativa e substituição de tecidos após lesão ou doença. As células-tronco pluripotentes têm se mostrado promissoras no tratamento de várias condições, incluindo, mas não se limitando a: lesões da medula espinhal , degeneração macular relacionada à idade , diabetes , doenças neurodegenerativas (como doença de Parkinson ), AIDS , etc. Além de seu potencial em Na medicina regenerativa, as células-tronco embrionárias fornecem uma possível fonte alternativa de tecidos / órgãos que servem como uma possível solução para o dilema da escassez de doadores. No entanto, existem algumas controvérsias éticas em torno disso (consulte a seção Debate ético abaixo). Além desses usos, os ESCs também podem ser usados ​​para pesquisas sobre o desenvolvimento humano inicial, certas doenças genéticas e testes de toxicologia in vitro .

Utilizações

De acordo com um artigo de 2002 na PNAS , "as células-tronco embrionárias humanas têm o potencial de se diferenciar em vários tipos de células e, portanto, podem ser úteis como uma fonte de células para transplante ou engenharia de tecidos."

Engenharia de Tecidos

Na engenharia de tecidos , o uso de células-tronco foi descoberto recentemente e é conhecido por sua importância. Para projetar um tecido com sucesso, as células utilizadas devem ser capazes de desempenhar funções biológicas específicas, como secreção de citocinas, moléculas de sinalização, interação com células vizinhas e produção de uma matriz extracelular na organização correta. As células-tronco demonstram essas funções biológicas específicas, além de serem capazes de se auto-renovar e se diferenciar em um ou mais tipos de células especializadas. As células-tronco embrionárias são uma das fontes atuais que estão sendo consideradas para o uso da engenharia de tecidos. O uso de células-tronco embrionárias humanas abriu muitas novas possibilidades para a engenharia de tecidos; no entanto, há muitos obstáculos que devem ser vencidos antes que as células-tronco embrionárias humanas possam ser utilizadas. É teorizado que se as células-tronco embrionárias podem ser alteradas para não evocar a resposta imune quando implantadas no paciente, então este seria um passo revolucionário na engenharia de tecidos.

Corpos embrióides 24 horas após a formação.

No entanto, as células-tronco embrionárias não se limitam à engenharia de células / tecidos.

Terapias de substituição celular

A pesquisa atual se concentra na diferenciação de ESCs em uma variedade de tipos de células para uso eventual como terapias de substituição de células (CRTs). Alguns dos tipos de células que foram ou estão sendo desenvolvidos incluem cardiomiócitos (CM), neurônios , hepatócitos , células da medula óssea , células das ilhotas e células endoteliais . No entanto, a derivação de tais tipos de células de ESCs não é sem obstáculos, portanto, a pesquisa atual está focada em superar essas barreiras. Por exemplo, estudos estão em andamento para diferenciar ESCs em CMs específicos para tecidos e para erradicar suas propriedades imaturas que os distinguem dos CMs adultos.

Potencial clínico

  • Os pesquisadores diferenciaram as CTEs em células produtoras de dopamina na esperança de que esses neurônios pudessem ser usados ​​no tratamento da doença de Parkinson.
  • As ESCs foram diferenciadas em células natural killer (NK) e tecido ósseo.
  • Estudos envolvendo ESCs estão em andamento para fornecer um tratamento alternativo para o diabetes. Por exemplo, D'Amour et al. foram capazes de diferenciar ESCs em células produtoras de insulina e os pesquisadores da Universidade de Harvard foram capazes de produzir grandes quantidades de células beta pancreáticas a partir de ES.
  • Um artigo publicado no European Heart Journal descreve um processo translacional de geração de células progenitoras cardíacas derivadas de células-tronco embrionárias humanas para serem usadas em ensaios clínicos de pacientes com insuficiência cardíaca grave.

Descoberta de drogas

Além de se tornar uma alternativa importante para o transplante de órgãos, os ESCs também estão sendo usados ​​no campo da toxicologia e como telas celulares para descobrir novas entidades químicas (NCEs) que podem ser desenvolvidas como drogas de pequenas moléculas. Estudos demonstraram que os cardiomiócitos derivados de ESCs são modelos in vitro validados para testar as respostas aos medicamentos e prever perfis de toxicidade. Foi demonstrado que os cardiomiócitos derivados de ES respondem a estímulos farmacológicos e, portanto, podem ser usados ​​para avaliar a cardiotoxicidade como Torsades de Pointes .

Os hepatócitos derivados de ESC também são modelos úteis que podem ser usados ​​nos estágios pré-clínicos da descoberta de drogas. No entanto, o desenvolvimento de hepatócitos a partir de ESCs tem se mostrado desafiador e isso dificulta a capacidade de testar o metabolismo de drogas. Portanto, a pesquisa atual está se concentrando no estabelecimento de hepatócitos derivados de ESC totalmente funcionais com atividade enzimática de fase I e II estável.

Modelos de desordem genética

Vários novos estudos começaram a abordar o conceito de modelagem de doenças genéticas com células-tronco embrionárias. Seja pela manipulação genética das células, ou, mais recentemente, pela derivação de linhagens celulares doentes identificadas por diagnóstico genético pré-natal (PGD), modelar distúrbios genéticos é algo que tem sido realizado com células-tronco. Essa abordagem pode muito bem ser valiosa no estudo de doenças como a síndrome do X-Frágil , a fibrose cística e outras doenças genéticas que não têm um sistema modelo confiável.

Yury Verlinsky , um pesquisador médico russo-americano especializado em genética embrionária e celular ( citologia genética ), desenvolveu métodos de teste de diagnóstico pré-natal para determinar distúrbios genéticos e cromossômicos um mês e meio antes da amniocentese padrão . As técnicas agora são usadas por muitas mulheres grávidas e futuros pais, especialmente casais com histórico de anormalidades genéticas ou em que a mulher tem mais de 35 anos (quando o risco de doenças geneticamente relacionadas é maior). Além disso, ao permitir que os pais selecionem um embrião sem distúrbios genéticos, eles têm o potencial de salvar a vida de irmãos que já apresentavam distúrbios e doenças semelhantes, usando células da prole livre de doenças.

Reparação de danos no DNA

Células somáticas diferenciadas e células ES usam estratégias diferentes para lidar com danos ao DNA. Por exemplo, fibroblastos de prepúcio humano, um tipo de célula somática, usam junção de extremidade não homóloga (NHEJ) , um processo de reparo de DNA sujeito a erros, como a via primária para reparar quebras de fita dupla (DSBs) durante todos os estágios do ciclo celular. Por causa de sua natureza propensa a erros, o NHEJ tende a produzir mutações nos descendentes clonais de uma célula.

As células ES usam uma estratégia diferente para lidar com os DSBs. Como as células ES dão origem a todos os tipos de células de um organismo, incluindo as células da linhagem germinativa, as mutações que surgem nas células ES devido ao reparo defeituoso do DNA são um problema mais sério do que em células somáticas diferenciadas. Consequentemente, mecanismos robustos são necessários nas células ES para reparar os danos ao DNA com precisão e, se o reparo falhar, para remover as células com danos ao DNA não reparados. Assim, as células ES de camundongo usam predominantemente o reparo recombinacional homólogo de alta fidelidade (HRR) para reparar DSBs. Este tipo de reparo depende da interação dos dois cromossomos irmãos formados durante a fase S e presentes juntos durante a fase G2 do ciclo celular. HRR pode reparar DSBs com precisão em um cromossomo irmão usando informações intactas do outro cromossomo irmão. As células na fase G1 do ciclo celular (ou seja, após a metáfase / divisão celular, mas antes da próxima rodada de replicação) têm apenas uma cópia de cada cromossomo (ou seja, cromossomos irmãos não estão presentes). As células ES de camundongo não têm um ponto de verificação G1 e não sofrem parada do ciclo celular ao adquirirem danos no DNA. Em vez disso, eles sofrem morte celular programada (apoptose) em resposta a danos no DNA. A apoptose pode ser usada como uma estratégia à prova de falhas para remover células com danos de DNA não reparados, a fim de evitar mutação e progressão para câncer. Consistente com essa estratégia, as células-tronco ES de camundongo têm uma frequência de mutação cerca de 100 vezes menor do que as células somáticas de camundongo isogênicas.

Ensaio clínico

Artigo principal: Ensaios clínicos com células-tronco embrionárias humanas

Em 23 de janeiro de 2009, os ensaios clínicos de Fase I para transplante de oligodendrócitos (um tipo de célula do cérebro e da medula espinhal) derivados de células ES humanas em indivíduos com lesão medular receberam a aprovação do US Food and Drug Administration (FDA), marcando é o primeiro teste com células ES humanas do mundo. O estudo que levou a esse avanço científico foi conduzido por Hans Keirstead e colegas da Universidade da Califórnia, Irvine, e apoiado pela Geron Corporation de Menlo Park, CA , fundada por Michael D. West , PhD. Um experimento anterior havia mostrado uma melhora na recuperação locomotora em ratos com lesão da medula espinhal após um transplante atrasado de 7 dias de células ES humanas que haviam sido empurradas para uma linhagem oligodendrocítica. O estudo clínico de fase I foi projetado para envolver cerca de oito a dez paraplégicos que tiveram seus ferimentos não mais do que duas semanas antes do início do ensaio, uma vez que as células devem ser injetadas antes que o tecido cicatricial possa se formar. Os pesquisadores enfatizaram que não se esperava que as injeções curassem totalmente os pacientes e restaurassem toda a mobilidade. Com base nos resultados dos testes com roedores, os pesquisadores especularam que a restauração das bainhas de mielina e um aumento na mobilidade podem ocorrer. Este primeiro ensaio foi projetado principalmente para testar a segurança desses procedimentos e se tudo corresse bem, esperava-se que levasse a estudos futuros que envolvam pessoas com deficiências mais graves. O teste foi suspenso em agosto de 2009 devido a preocupações da FDA em relação a um pequeno número de cistos microscópicos encontrados em vários modelos de ratos tratados, mas a suspensão foi suspensa em 30 de julho de 2010.

Em outubro de 2010, os pesquisadores inscreveram e administraram ESTs ao primeiro paciente do Shepherd Center em Atlanta . Os fabricantes da terapia com células-tronco, Geron Corporation , estimaram que levaria vários meses para as células-tronco se replicarem e para a terapia GRNOPC1 ser avaliada quanto ao sucesso ou fracasso.

Em novembro de 2011, a Geron anunciou que estava interrompendo o teste e abandonando a pesquisa com células-tronco por razões financeiras, mas continuaria monitorando os pacientes existentes e estava tentando encontrar um parceiro que pudesse continuar sua pesquisa. Em 2013 , a BioTime , liderada pelo CEO Dr. Michael D. West , adquiriu todos os ativos de células-tronco da Geron, com a intenção declarada de reiniciar o ensaio clínico baseado em células-tronco embrionárias da Geron para pesquisa de lesão medular .

A empresa Asterias Biotherapeutics (NYSE MKT: AST) da BioTime recebeu o prêmio Strategic Partnership Award de $ 14,3 milhões do California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) para reiniciar o primeiro ensaio clínico em humanos baseado em células-tronco embrionárias para lesão da medula espinhal. Apoiado por fundos públicos da Califórnia, o CIRM é o maior financiador de pesquisa e desenvolvimento relacionados a células-tronco do mundo.

O prêmio fornece financiamento para o Asterias reiniciar o desenvolvimento clínico de AST-OPC1 em indivíduos com lesão da medula espinhal e expandir os testes clínicos de doses crescentes na população-alvo destinada a futuros testes essenciais.

AST-OPC1 é uma população de células derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) que contém células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs). OPCs e seus derivados maduros chamados oligodendrócitos fornecem suporte funcional crítico para as células nervosas na medula espinhal e no cérebro. Asterias recentemente apresentou os resultados do teste clínico de fase 1 de uma dose baixa de AST-OPC1 em pacientes com lesão neurologicamente completa da medula espinhal torácica. Os resultados mostraram que AST-OPC1 foi entregue com sucesso no local lesado da medula espinhal. Os pacientes acompanhados 2-3 anos após a administração de AST-OPC1 não mostraram evidências de eventos adversos graves associados às células em avaliações de acompanhamento detalhadas, incluindo exames neurológicos frequentes e ressonâncias magnéticas. O monitoramento imunológico de indivíduos durante um ano após o transplante não mostrou evidências de respostas imunes celulares ou baseadas em anticorpos para AST-OPC1. Em quatro dos cinco indivíduos, exames de ressonância magnética em série realizados durante o período de acompanhamento de 2–3 anos indicam que pode ter ocorrido redução da cavitação da medula espinhal e que AST-OPC1 pode ter tido alguns efeitos positivos na redução da deterioração do tecido da medula espinhal. Não houve degeneração neurológica inesperada ou melhora nos cinco indivíduos do estudo, conforme avaliado pelo exame de Padrões Internacionais para Classificação Neurológica de Lesão da Medula Espinhal (ISNCSCI).

A concessão da Parceria Estratégica III do CIRM fornecerá financiamento para Asterias para apoiar o próximo ensaio clínico de AST-OPC1 em indivíduos com lesão da medula espinhal, e para os esforços de desenvolvimento de produto da Asterias para refinar e dimensionar métodos de fabricação para apoiar ensaios em estágios posteriores e, eventualmente, comercialização. O financiamento do CIRM estará condicionado à aprovação do FDA para o teste, à conclusão de um acordo definitivo entre a Asterias e a CIRM e ao progresso contínuo da Asterias em direção à realização de certos marcos predefinidos do projeto.

Preocupação e controvérsia

Efeitos adversos

A principal preocupação com o possível transplante de ESC em pacientes como terapias é sua capacidade de formar tumores, incluindo teratoma. Questões de segurança levaram o FDA a suspender o primeiro ensaio clínico da ESC, no entanto, nenhum tumor foi observado.

A principal estratégia para aumentar a segurança da ESC para uso clínico potencial é diferenciar a ESC em tipos de células específicos (por exemplo, neurônios, músculos, células do fígado) que reduziram ou eliminaram a capacidade de causar tumores. Após a diferenciação, as células são submetidas a classificação por citometria de fluxo para purificação adicional. Prevê-se que as ESC são inerentemente mais seguras do que as células IPS criadas com vetores virais que se integram geneticamente porque não são geneticamente modificadas com genes como o c-Myc, que estão ligados ao câncer. No entanto, ESC expressam níveis muito elevados de genes indutores de iPS e esses genes, incluindo Myc, são essenciais para a autorrenovação e pluripotência de ESC, e estratégias potenciais para melhorar a segurança eliminando a expressão de c-Myc são improváveis ​​de preservar a "haste" das células. No entanto, N-myc e L-myc foram identificados para induzir células iPS em vez de c-myc com eficiência semelhante. Protocolos mais recentes para induzir a pluripotência contornam esses problemas completamente usando vetores virais de RNA não integrados, como vírus sendai ou transfecção de mRNA .

Debate ético

Artigo principal: Controvérsia sobre células-tronco

Devido à natureza da pesquisa com células-tronco embrionárias, existem muitas opiniões controversas sobre o assunto. Visto que a coleta de células-tronco embrionárias exige a destruição do embrião do qual essas células são obtidas, o status moral do embrião é questionado. Algumas pessoas afirmam que a massa de células de 5 dias é muito jovem para se tornar uma pessoa ou que o embrião, se doado por uma clínica de fertilização in vitro (que é onde os laboratórios normalmente adquirem embriões), caso contrário iria para o lixo hospitalar de qualquer maneira. Os oponentes da pesquisa do ESC afirmam que um embrião é uma vida humana, portanto destruí-lo é um assassinato e o embrião deve ser protegido sob a mesma visão ética de um ser humano mais desenvolvido.

História

  • 1964: Lewis Kleinsmith e G. Barry Pierce Jr. isolaram um único tipo de célula de um teratocarcinoma , um tumor agora conhecido a partir de uma célula germinativa . Essas células foram isoladas do teratocarcinoma replicado e cresceram em cultura de células como uma célula-tronco e agora são conhecidas como células de carcinoma embrionário (CE). Embora semelhanças na morfologia e potencial de diferenciação ( pluripotência ) tenham levado ao uso de células EC como o modelo in vitro para o desenvolvimento inicial de camundongos, as células EC abrigam mutações genéticas e frequentemente cariótipos anormais que se acumularam durante o desenvolvimento do teratocarcinoma . Essas aberrações genéticas enfatizaram ainda mais a necessidade de ser capaz de cultivar células pluripotentes diretamente da massa celular interna .
Martin Evans revelou uma nova técnica para cultivar embriões de camundongos no útero para permitir a derivação de células ES a partir desses embriões.
  • 1981: As células-tronco embrionárias (células ES) foram primeiro derivadas independentemente de embriões de camundongo por dois grupos. Martin Evans e Matthew Kaufman do Departamento de Genética da Universidade de Cambridge publicaram primeiro em julho, revelando uma nova técnica para cultivar embriões de camundongo no útero para permitir um aumento no número de células, permitindo a derivação de células ES a partir desses embriões . Gail R. Martin , do Departamento de Anatomia da Universidade da Califórnia, San Francisco , publicou seu artigo em dezembro e cunhou o termo “Célula-tronco embrionária”. Ela mostrou que os embriões podem ser cultivados in vitro e que as células ES podem ser derivadas desses embriões.
  • 1989: Mario R. Cappechi, Martin J. Evans e Oliver Smithies publicam sua pesquisa que detalha seu isolamento e modificações genéticas de células-tronco embrionárias, criando os primeiros " ratos nocaute ". Ao criar ratos nocaute, esta publicação forneceu aos cientistas uma maneira inteiramente nova de estudar doenças.
  • 1998: Uma equipe da Universidade de Wisconsin, Madison (James A. Thomson, Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall e Jeffrey M. Jones) publica um artigo intitulado "Embryonic Stem Cell Lines Derived From Human Blastocysts". Os pesquisadores por trás deste estudo não apenas criaram as primeiras células-tronco embrionárias, mas reconheceram sua pluripotência, bem como sua capacidade de auto-renovação. O resumo do artigo observa o significado da descoberta no que diz respeito aos campos da biologia do desenvolvimento e descoberta de drogas.
  • 2001: O presidente George W. Bush permite financiamento federal para apoiar a pesquisa de cerca de 60 - atualmente, já existentes - linhas de células-tronco embrionárias. Visto que já estavam estabelecidas as linhas limitadas que Bush permitia a pesquisa, essa lei apoiou a pesquisa com células-tronco embrionárias sem levantar quaisquer questões éticas que pudessem surgir com a criação de novas rubricas no orçamento federal.
  • 2006: Os cientistas japoneses Shinya Yamanaka e Kazutoshi Takashi publicam um artigo que descreve a indução de células-tronco pluripotentes em culturas de fibroblastos de camundongos adultos . As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma grande descoberta, pois são aparentemente idênticas às células-tronco embrionárias e podem ser usadas sem gerar a mesma controvérsia moral.
  • Janeiro de 2009: A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA aprovou o ensaio de fase I da Geron Corporation para o tratamento de lesões da medula espinhal derivadas de células-tronco embrionárias humanas . O anúncio foi recebido com entusiasmo pela comunidade científica, mas também com cautela por parte dos opositores das células-tronco. As células de tratamento foram, no entanto, derivadas de linhas celulares aprovadas pela política ESC de George W. Bush .
  • Março de 2009: A Ordem Executiva 13505 é assinada pelo presidente Barack Obama , removendo as restrições impostas ao financiamento federal para células-tronco humanas pelo governo presidencial anterior. Isso permitiria aos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) fornecer financiamento para pesquisas de hESC. O documento também afirma que o NIH deve fornecer diretrizes revisadas de financiamento federal no prazo de 120 dias após a assinatura do pedido.

Técnicas e condições para derivação e cultura

Derivação de humanos

A fertilização in vitro gera vários embriões. O excedente de embriões não é usado clinicamente ou não é adequado para implantação no paciente e, portanto, pode ser doado pelo doador com consentimento. As células-tronco embrionárias humanas podem ser derivadas desses embriões doados ou, adicionalmente, também podem ser extraídas de embriões clonados usando uma célula de um paciente e um óvulo doado. A massa celular interna (células de interesse), do estágio de blastocisto do embrião, é separada do trofectoderma, as células que se diferenciariam em tecido extra-embrionário. Imunocirurgia, processo no qual os anticorpos são ligados ao trofectoderma e removidos por outra solução, e a dissecção mecânica é realizada para obter a separação. As células de massa celular interna resultantes são plaqueadas em células que fornecerão suporte. As células da massa celular interna se fixam e se expandem ainda mais para formar uma linha de células embrionárias humanas, que são indiferenciadas. Essas células são alimentadas diariamente e são separadas enzimaticamente ou mecanicamente a cada quatro a sete dias. Para que a diferenciação ocorra, a linha de células-tronco embrionárias humanas é removida das células de suporte para formar corpos embrióides, é co-cultivada com um soro contendo os sinais necessários ou é enxertada em uma estrutura tridimensional para resultar.

Derivação de outros animais

As células-tronco embrionárias são derivadas da massa celular interna do embrião inicial , que são colhidas do animal-mãe doador. Martin Evans e Matthew Kaufman relataram uma técnica que retarda a implantação do embrião, permitindo que a massa celular interna aumente. Esse processo inclui a remoção dos ovários da mãe doadora e a administração de progesterona , alterando o ambiente hormonal, o que faz com que os embriões permaneçam livres no útero. Após 4-6 dias desta cultura intrauterina, os embriões são colhidos e cultivados em cultura in vitro até que a massa celular interna forme "estruturas semelhantes a cilindros de ovo", que são dissociadas em células únicas e plaqueadas em fibroblastos tratados com mitomicina-c (para prevenir a mitose de fibroblastos ). As linhas celulares clonais são criadas pelo crescimento de uma única célula. Evans e Kaufman mostraram que as células crescidas a partir dessas culturas podem formar teratomas e corpos embrióides , e se diferenciar in vitro, o que indica que as células são pluripotentes .

Gail Martin derivou e cultivou suas células ES de maneira diferente. Ela removeu os embriões da mãe doadora aproximadamente 76 horas após a cópula e os cultivou durante a noite em um meio contendo soro. No dia seguinte, ela removeu a massa celular interna do blastocisto tardio usando microcirurgia . A massa celular interna extraída foi cultivada em fibroblastos tratados com mitomicina-c em meio contendo soro e condicionada por células ES. Após aproximadamente uma semana, as colônias de células cresceram. Essas células cresceram em cultura e demonstraram características pluripotentes , conforme demonstrado pela capacidade de formar teratomas , se diferenciar in vitro e formar corpos embrióides . Martin se referiu a essas células como células ES.

Sabe-se agora que as células alimentadoras fornecem fator inibidor de leucemia (LIF) e o soro fornece proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) que são necessárias para prevenir a diferenciação das células ES. Esses fatores são extremamente importantes para a eficiência de derivar células ES. Além disso, foi demonstrado que diferentes cepas de camundongos têm diferentes eficiências para o isolamento de células ES. Os usos atuais de células ES de camundongo incluem a geração de camundongos transgênicos , incluindo camundongos knockout . Para o tratamento humano, há necessidade de células pluripotentes específicas do paciente. A geração de células ES humanas é mais difícil e enfrenta questões éticas. Portanto, além da pesquisa com células ES humanas, muitos grupos estão focados na geração de células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS).

Métodos potenciais para derivação de nova linha celular

Em 23 de agosto de 2006, a edição online da revista científica Nature publicou uma carta do Dr. Robert Lanza (diretor médico da Advanced Cell Technology em Worcester, MA) afirmando que sua equipe havia encontrado uma maneira de extrair células-tronco embrionárias sem destruir o embrião. Esta conquista técnica permitiria potencialmente que os cientistas trabalhassem com novas linhas de células-tronco embrionárias derivadas de financiamento público nos Estados Unidos, onde o financiamento federal era na época limitado à pesquisa usando linhas de células-tronco embrionárias derivadas antes de agosto de 2001. Em março de 2009, a limitação foi levantada.

As células-tronco embrionárias humanas também foram derivadas por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) . Esta abordagem também tem sido algumas vezes referida como "clonagem terapêutica" porque o SCNT tem semelhança com outros tipos de clonagem em que os núcleos são transferidos de uma célula somática para um zigoto enucleado. No entanto, neste caso, o SCNT foi usado para produzir linhas de células-tronco embrionárias em um laboratório, não organismos vivos por meio de uma gravidez. A parte "terapêutica" do nome foi incluída devido à esperança de que células-tronco embrionárias produzidas por SCNT pudessem ter utilidade clínica.

Células-tronco pluripotentes induzidas

Artigo principal: Célula-tronco pluripotente induzida

A tecnologia iPSC foi desenvolvida pelo laboratório de Shinya Yamanaka em Kyoto , Japão , que mostrou em 2006 que a introdução de quatro genes específicos que codificam fatores de transcrição podem converter células adultas em células-tronco pluripotentes. Ele recebeu o Prêmio Nobel de 2012 junto com Sir John Gurdon "pela descoberta de que células maduras podem ser reprogramadas para se tornarem pluripotentes".

Em 2007, foi demonstrado que células- tronco pluripotentes altamente semelhantes às células-tronco embrionárias podem ser geradas pela entrega de três genes ( Oct4 , Sox2 e Klf4 ) para células diferenciadas. A entrega desses genes "reprograma" células diferenciadas em células-tronco pluripotentes, permitindo a geração de células-tronco pluripotentes sem o embrião. Como as preocupações éticas com relação às células-tronco embrionárias normalmente são sobre sua derivação de embriões terminados, acredita-se que a reprogramação para essas "células-tronco pluripotentes induzidas" (células iPS) pode ser menos controverso. As células humanas e de camundongo podem ser reprogramadas por esta metodologia, gerando células-tronco pluripotentes humanas e células-tronco pluripotentes de camundongo sem embrião.

Isso pode permitir a geração de linhas de células ES específicas do paciente que poderiam ser potencialmente usadas para terapias de substituição de células. Além disso, isso permitirá a geração de linhas de células ES de pacientes com uma variedade de doenças genéticas e fornecerá modelos valiosos para estudar essas doenças.

No entanto, como uma primeira indicação de que a tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) pode em rápida sucessão levar a novas curas, ela foi usada por uma equipe de pesquisa liderada por Rudolf Jaenisch do Instituto Whitehead para Pesquisa Biomédica em Cambridge , Massachusetts , para curar ratos com anemia falciforme , conforme relatado pela edição online da revista Science em 6 de dezembro de 2007.

Em 16 de janeiro de 2008, uma empresa sediada na Califórnia, Stemagen, anunciou que havia criado os primeiros embriões humanos clonados maduros a partir de células isoladas da pele retiradas de adultos. Esses embriões podem ser colhidos para células-tronco embrionárias correspondentes ao paciente.

Contaminação por reagentes usados ​​na cultura de células

A edição online da Nature Medicine publicou um estudo em 24 de janeiro de 2005, afirmando que as células-tronco embrionárias humanas disponíveis para pesquisas financiadas pelo governo federal estão contaminadas com moléculas não humanas do meio de cultura usado para cultivar as células. É uma técnica comum usar células de camundongo e outras células animais para manter a pluripotência das células-tronco em divisão ativa. O problema foi descoberto quando o ácido siálico não humano no meio de crescimento comprometeu os usos potenciais das células-tronco embrionárias em humanos, de acordo com cientistas da Universidade da Califórnia, em San Diego .

No entanto, um estudo publicado na edição online do Lancet Medical Journal em 8 de março de 2005 detalhou informações sobre uma nova linha de células-tronco derivada de embriões humanos em condições completamente livres de células e soro. Após mais de 6 meses de proliferação indiferenciada, essas células demonstraram o potencial de formar derivados de todas as três camadas germinativas embrionárias, tanto in vitro quanto em teratomas . Essas propriedades também foram mantidas com sucesso (por mais de 30 passagens) com as linhas de células-tronco estabelecidas.

Veja também

Referências

links externos