inibidor enzimático -Enzyme inhibitor

desenho animado de uma enzima ligando o substrato ao seu sítio ativo e liberando o produto (topo), e um inibidor ligando-se ao sítio ativo, evitando assim a ligação do substrato
Acima: a enzima (E) acelera a conversão de substratos (S) em produtos (P). Abaixo: ao se ligar à enzima, o inibidor (I) bloqueia a ligação do substrato. Local de ligação mostrado em tabuleiro de xadrez azul, substrato como retângulo preto e inibidor como retângulo arredondado verde.

Um inibidor enzimático é uma molécula que se liga a uma enzima e bloqueia sua atividade . As enzimas são proteínas que aceleram as reações químicas necessárias à vida , nas quais moléculas de substrato são convertidas em produtos . Uma enzima facilita uma reação química específica ligando o substrato ao seu sítio ativo , uma área especializada na enzima que acelera a etapa mais difícil da reação .

Um inibidor enzimático interrompe ("inibe") esse processo, ligando-se ao local ativo da enzima (impedindo assim que o próprio substrato se ligue) ou ligando-se a outro local na enzima, de modo que a catálise da reação da enzima seja bloqueada . Os inibidores enzimáticos podem se ligar de forma reversível ou irreversível. Os inibidores irreversíveis formam uma ligação química com a enzima de modo que a enzima seja inibida até que a ligação química seja quebrada. Por outro lado, os inibidores reversíveis se ligam de forma não covalente e podem deixar a enzima espontaneamente, permitindo que a enzima retome sua função. Os inibidores reversíveis produzem diferentes tipos de inibição, dependendo se eles se ligam à enzima, ao complexo enzima-substrato ou a ambos.

Os inibidores enzimáticos desempenham um papel importante em todas as células, pois geralmente são específicos para uma enzima cada e servem para controlar a atividade dessa enzima. Por exemplo, as enzimas em uma via metabólica podem ser inibidas por moléculas produzidas posteriormente na via, reduzindo assim a produção de moléculas que não são mais necessárias. Este tipo de feedback negativo é uma forma importante de manter o equilíbrio em uma célula . Os inibidores enzimáticos também controlam enzimas essenciais, como proteases ou nucleases que, se não forem controladas, podem danificar uma célula. Muitos venenos produzidos por animais ou plantas são inibidores de enzimas que bloqueiam a atividade de enzimas cruciais em presas ou predadores .

Muitas moléculas de drogas são inibidores de enzimas que inibem uma enzima humana aberrante ou uma enzima crítica para a sobrevivência de um patógeno , como um vírus , bactéria ou parasita . Os exemplos incluem o metotrexato (usado na quimioterapia e no tratamento da artrite reumática ) e os inibidores de protease usados ​​no tratamento do HIV/AIDS . Uma vez que os inibidores antipatógenos geralmente visam apenas uma enzima, tais drogas são altamente específicas e geralmente produzem poucos efeitos colaterais em humanos, desde que nenhuma enzima análoga seja encontrada em humanos. (Este é frequentemente o caso, uma vez que tais patógenos e humanos são geneticamente distantes .) Os inibidores de enzimas medicinais geralmente têm baixas constantes de dissociação , o que significa que apenas uma pequena quantidade do inibidor é necessária para inibir a enzima. Uma baixa concentração do inibidor da enzima reduz o risco de danos hepáticos e renais e outras reações adversas a medicamentos em humanos. Portanto, a descoberta e refinamento de inibidores enzimáticos é uma área ativa de pesquisa em bioquímica e farmacologia .

classes estruturais

Os inibidores enzimáticos são um conjunto quimicamente diverso de substâncias que variam em tamanho, desde pequenas moléculas orgânicas até proteínas macromoleculares .

Inibidores de moléculas pequenas incluem metabólitos primários essenciais que inibem enzimas a montante que produzem esses metabólitos. Isso fornece um ciclo de feedback negativo que evita a superprodução de metabólitos e, assim, mantém a homeostase celular (condições internas estáveis). Os inibidores de enzimas de moléculas pequenas também incluem metabólitos secundários , que não são essenciais para o organismo que os produz, mas fornecem ao organismo uma vantagem evolutiva, pois podem ser usados ​​para repelir predadores ou organismos concorrentes ou imobilizar presas. Além disso, muitas drogas são inibidores enzimáticos de moléculas pequenas que têm como alvo as enzimas modificadoras da doença no paciente ou as enzimas em patógenos que são necessários para o crescimento e reprodução do patógeno.

Além de pequenas moléculas, algumas proteínas atuam como inibidores enzimáticos. O exemplo mais proeminente são as serpinas ( serina p rotease em inibidores) que são produzidas por animais para proteger contra ativação inapropriada de enzimas e por plantas para prevenir a predação . Outra classe de proteínas inibidoras são os inibidores de ribonuclease , que se ligam às ribonucleases em uma das interações proteína-proteína mais estreitas conhecidas . Um caso especial de inibidores enzimáticos proteicos são os zimogênios que contêm um peptídeo N-terminal autoinibitório que se liga ao sítio ativo da enzima que bloqueia intramolecularmente sua atividade como um mecanismo protetor contra a catálise descontrolada. O peptídeo N-terminal é clivado (dividido) do precursor da enzima zimogênio por outra enzima para liberar uma enzima ativa.

O sítio de ligação dos inibidores nas enzimas é mais comumente o mesmo sítio que liga o substrato da enzima. Esses inibidores de sítio ativo são conhecidos como inibidores ortostéricos (orientação "regular"). O mecanismo de inibição ortostérica é simplesmente impedir a ligação do substrato à enzima através da competição direta que, por sua vez, impede a enzima de catalisar a conversão de substratos em produtos. Alternativamente, o inibidor pode se ligar a um sítio remoto do sítio ativo da enzima. Estes são conhecidos como inibidores alostéricos (orientação "alternativa"). Os mecanismos de inibição alostérica são variados e incluem a alteração da conformação (forma) da enzima de modo que ela não possa mais se ligar ao substrato ( cineticamente indistinguível da inibição ortostérica competitiva) ou, alternativamente, estabilizar a ligação do substrato à enzima, mas bloquear a enzima em uma conformação que não é mais cataliticamente ativo.

Inibidores reversíveis

Esquema do mecanismo de inibição
fórmula de reação de equilíbrio químico para inibição competitiva, não competitiva, não competitiva e mista
Mecanismos cinéticos para inibição reversível. Substrato (S) ligando-se à enzima (E) em azul, produto liberador de catálise (P) em vermelho, inibidor (I) ligando-se à enzima em verde.
diagrama esquemático dos três tipos de inibidores reversíveis
Esquemas para inibição reversível. Sítio de ligação em azul, substrato em preto, inibidor em verde e sítio alostérico em verde claro.
Os inibidores competitivos geralmente se ligam ao sítio ativo. Ligação não competitiva a um site remoto (alostérico). Os inibidores não competitivos se ligam apenas quando o substrato está ligado, interrompendo totalmente a catálise, e a inibição mista é semelhante, mas com apenas a interrupção parcial da catálise.

Inibidores reversíveis se ligam a enzimas com interações não covalentes, como ligações de hidrogênio , interações hidrofóbicas e ligações iônicas . Múltiplas ligações fracas entre o inibidor e o sítio ativo da enzima se combinam para produzir uma ligação forte e específica.

Ao contrário dos inibidores irreversíveis, os inibidores reversíveis geralmente não sofrem reações químicas quando ligados à enzima e podem ser facilmente removidos por diluição ou diálise . Um caso especial são os inibidores reversíveis covalentes que formam uma ligação química com a enzima, mas a ligação pode ser quebrada para que a inibição seja totalmente reversível.

Os inibidores reversíveis são geralmente classificados em quatro tipos, conforme introduzido por Cleland em 1963. Eles são classificados de acordo com o efeito do inibidor no Vmax (taxa máxima de reação catalisada pela enzima) e Km ( a concentração de substrato resultando em metade atividade enzimática máxima) à medida que a concentração do substrato da enzima é variada.

Competitivo

Na inibição competitiva, o substrato e o inibidor não podem se ligar à enzima ao mesmo tempo. Isso geralmente resulta do inibidor ter uma afinidade pelo sítio ativo de uma enzima onde o substrato também se liga; o substrato e o inibidor competem pelo acesso ao sítio ativo da enzima. Este tipo de inibição pode ser superado por concentrações suficientemente altas de substrato ( Vmax permanece constante), ou seja , superando o inibidor em competição. No entanto, o K m aparente aumentará à medida que for necessária uma concentração maior do substrato para atingir o ponto K m , ou seja, metade do V máx . Os inibidores competitivos são frequentemente semelhantes em estrutura ao substrato real (ver, por exemplo, a figura "metotrexato versus folato" na seção "Fármacos" ).

Não-competitivo

Na inibição acompetitiva, o inibidor liga-se apenas ao complexo enzima-substrato. Este tipo de inibição faz com que V max diminua (a velocidade máxima diminui como resultado da remoção do complexo ativado) e K m diminui (devido a uma melhor eficiência de ligação como resultado do princípio de Le Chatelier e a eliminação efetiva do complexo ES, diminuindo assim o K m que indica uma afinidade de ligação mais elevada). Inibição não competitiva é rara.

Não competitivo

Na inibição não competitiva, a ligação do inibidor à enzima reduz sua atividade , mas não afeta a ligação do substrato. Como resultado, a extensão da inibição depende apenas da concentração do inibidor. V máx diminuirá devido à incapacidade da reação prosseguir com a mesma eficiência, mas K m permanecerá o mesmo, pois a ligação real do substrato, por definição, ainda funcionará adequadamente.

Misturado

Na inibição mista, o inibidor pode se ligar à enzima quer o substrato já tenha se ligado ou não. Portanto, a inibição mista é uma combinação de inibição competitiva e não competitiva. Além disso, a afinidade do inibidor pela enzima livre e pelo complexo enzima-substrato pode diferir. Ao aumentar as concentrações de substrato [S], esse tipo de inibição pode ser reduzido (devido à contribuição competitiva), mas não totalmente superado (devido ao componente não competitivo). Embora seja possível que os inibidores do tipo misto se liguem ao sítio ativo, esse tipo de inibição geralmente resulta de um efeito alostérico em que o inibidor se liga a um sítio diferente de uma enzima. A ligação do inibidor a esse sítio alostérico altera a conformação (isto é, a estrutura terciária ou a forma tridimensional) da enzima, de modo que a afinidade do substrato pelo sítio ativo é reduzida.

Esses quatro tipos de inibição também podem ser distinguidos pelo efeito do aumento da concentração de substrato [S] no grau de inibição causado por uma determinada quantidade de inibidor. Para inibição competitiva, o grau de inibição é reduzido pelo aumento de [S], para inibição não competitiva, o grau de inibição permanece inalterado, e para inibição não competitiva (também chamada de anticompetitiva), o grau de inibição aumenta com [S].

descrição quantitativa

A inibição reversível pode ser descrita quantitativamente em termos da ligação do inibidor à enzima e ao complexo enzima-substrato e seus efeitos nas constantes cinéticas da enzima. No esquema clássico de Michaelis-Menten (mostrado no diagrama "esquemático do mecanismo de inibição"), uma enzima (E) liga-se ao seu substrato (S) para formar o complexo enzima-substrato ES. Após a catálise, esse complexo se decompõe para liberar o produto P e a enzima livre. O inibidor (I) pode se ligar a E ou ES com as constantes de dissociação K i ou K i ', respectivamente.

  • Inibidores competitivos podem se ligar a E, mas não a ES. A inibição competitiva aumenta o K m (ou seja, o inibidor interfere na ligação do substrato), mas não afeta o V máx (o inibidor não dificulta a catálise no ES porque não pode se ligar ao ES).
  • Os inibidores não competitivos se ligam ao ES. A inibição não competitiva diminui tanto o K m quanto o V máx . O inibidor afeta a ligação do substrato aumentando a afinidade da enzima pelo substrato (diminuindo o K m ), bem como dificultando a catálise (diminuindo o V máx ).
  • Os inibidores não competitivos têm afinidades idênticas para E e ES ( K i = K i '). A inibição não competitiva não altera o K m (ou seja, não afeta a ligação do substrato), mas diminui o V máx (ou seja, a ligação do inibidor dificulta a catálise).
  • Os inibidores do tipo misto ligam-se tanto a E quanto a ES, mas suas afinidades por essas duas formas da enzima são diferentes ( K iK i '). Assim, os inibidores do tipo misto afetam a ligação do substrato (aumentam ou diminuem o K m ) e dificultam a catálise no complexo ES (diminuem o V máx ).

Quando uma enzima tem vários substratos, os inibidores podem apresentar diferentes tipos de inibição, dependendo de qual substrato é considerado. Isso resulta do sítio ativo conter dois sítios de ligação diferentes dentro do sítio ativo, um para cada substrato. Por exemplo, um inibidor pode competir com o substrato A pelo primeiro sítio de ligação, mas ser um inibidor não competitivo em relação ao substrato B no segundo sítio de ligação.

Tradicionalmente, os inibidores enzimáticos reversíveis têm sido classificados como competitivos, não competitivos ou não competitivos, de acordo com seus efeitos sobre K m e V máx . Esses três tipos de inibição resultam, respectivamente, da ligação do inibidor apenas à enzima E na ausência do substrato S, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos. A divisão dessas classes surge de um problema em sua derivação e resulta na necessidade de usar duas constantes de ligação diferentes para um evento de ligação. Supõe-se ainda que a ligação do inibidor à enzima resulta em 100% de inibição e não considera a possibilidade de inibição parcial. A forma comum do termo inibitório também obscurece a relação entre a ligação do inibidor à enzima e sua relação com qualquer outro termo de ligação, seja a equação de Michaelis-Menten ou uma curva dose-resposta associada à ligação do receptor do ligante. Para demonstrar a relação, o seguinte rearranjo pode ser feito:

Este rearranjo demonstra que, semelhante à equação de Michaelis-Menten, a taxa máxima de reação depende da proporção da população de enzimas interagindo com seu substrato.

fração da população de enzimas ligada pelo substrato

fração da população enzimática ligada pelo inibidor

o efeito do inibidor é resultado da porcentagem da população de enzimas interagindo com o inibidor. O único problema com esta equação em sua forma atual é que ela assume a inibição absoluta da enzima com a ligação do inibidor, quando na verdade pode haver uma ampla gama de efeitos em qualquer lugar, desde 100% de inibição do retorno do substrato até nenhuma inibição. Para levar em conta isso , a equação pode ser facilmente modificada para permitir diferentes graus de inibição, incluindo um termo delta Vmax .

ou

Este termo pode então definir a atividade enzimática residual presente quando o inibidor está interagindo com enzimas individuais na população. No entanto, a inclusão deste termo tem o valor agregado de permitir a possibilidade de ativação se o termo V máx secundário for maior que o termo inicial. Para levar em conta também a possibilidade de ativação, a notação pode então ser reescrita substituindo o inibidor "I" por um termo modificador (estimulador ou inibidor) denotado aqui como "X".

Embora essa terminologia resulte em uma maneira simplificada de lidar com os efeitos cinéticos relacionados à velocidade máxima da equação de Michaelis-Menten, ela destaca problemas potenciais com o termo usado para descrever os efeitos relacionados ao K m . O Km relativo à afinidade da enzima para o substrato deve, na maioria dos casos, estar relacionado a alterações potenciais no local de ligação da enzima que resultariam diretamente das interações do inibidor da enzima . Como tal, um termo semelhante ao termo delta V máx proposto acima para modular V máx deve ser apropriado na maioria das situações:

constantes de dissociação

Gráficos 2D de concentração 1/[S] (eixo x) e 1/V (eixo y) demonstrando que, conforme a concentração do inibidor é alterada, as linhas do inibidor competitivo se cruzam em um único ponto no eixo y, os inibidores não competitivos se cruzam no eixo x, e os inibidores mistos interceptam um ponto que não está em nenhum dos eixos
Diagramas de Lineweaver-Burk de diferentes tipos de inibidores de enzimas reversíveis. A seta mostra o efeito de aumentar as concentrações de inibidor.

Um inibidor enzimático é caracterizado por sua constante de dissociação K i , a concentração na qual a metade inibidora ocupa a enzima. Na inibição não competitiva, o inibidor também pode se ligar ao complexo enzima-substrato, e a presença do substrato ligado pode alterar a afinidade do inibidor pela enzima, resultando em uma segunda constante de dissociação K i ' . Portanto, K i e K i ' são as constantes de dissociação do inibidor para a enzima e para o complexo enzima-substrato, respectivamente. A constante K i do inibidor da enzima pode ser medida diretamente por vários métodos; um método especialmente preciso é a calorimetria de titulação isotérmica , na qual o inibidor é titulado em uma solução de enzima e o calor liberado ou absorvido é medido. No entanto, a outra constante de dissociação K i ' é difícil de medir diretamente, uma vez que o complexo enzima-substrato tem vida curta e sofre uma reação química para formar o produto. Portanto, K i ' geralmente é medido indiretamente, observando a atividade da enzima sob várias concentrações de substrato e inibidor e ajustando os dados por meio de regressão não linear a uma equação de Michaelis–Menten modificada .

onde os fatores modificadores α e α' são definidos pela concentração do inibidor e suas duas constantes de dissociação

Assim, na presença do inibidor, o K m e V máx efetivos da enzima tornam-se (α/α') K m e (1/α') V máx , respectivamente. No entanto, a equação de Michaelis-Menten modificada assume que a ligação do inibidor à enzima atingiu o equilíbrio, o que pode ser um processo muito lento para inibidores com constantes de dissociação sub-nanomolares. Nesses casos, a inibição torna-se efetivamente irreversível, portanto, é mais prático tratar esses inibidores de ligação forte como irreversíveis (ver abaixo ).

Os efeitos de diferentes tipos de inibidores reversíveis da enzima na atividade enzimática podem ser visualizados usando representações gráficas da equação de Michaelis-Menten, como gráficos de Lineweaver-Burk , Eadie-Hofstee ou Hanes-Woolf . Uma ilustração é fornecida pelos três gráficos de Lineweaver-Burk representados na figura dos diagramas de Lineweaver-Burk . No diagrama superior, as linhas de inibição competitiva se cruzam no eixo y , ilustrando que tais inibidores não afetam V máx . No diagrama inferior, as linhas de inibição não competitiva se cruzam no eixo x , mostrando que esses inibidores não afetam o K m . No entanto, como pode ser difícil estimar K i e K i ' com precisão a partir desses gráficos, é aconselhável estimar essas constantes usando métodos de regressão não linear mais confiáveis.

Casos especiais

Parcialmente competitivo

O mecanismo da inibição parcialmente competitiva é semelhante ao da não competitiva, exceto que o complexo EIS tem atividade catalítica, que pode ser menor ou até maior (ativação parcialmente competitiva) do que o complexo enzima-substrato (ES). Essa inibição normalmente exibe um Vmax mais baixo , mas um valor de Km não afetado.

Substrato ou produto

Inibição de substrato ou produto é quando um substrato ou produto de enzimas também atua como um inibidor. Essa inibição pode seguir os padrões competitivos, não competitivos ou mistos. Na inibição do substrato, há uma diminuição progressiva da atividade em altas concentrações de substrato, possivelmente a partir de uma enzima com dois locais concorrentes de ligação ao substrato. Em substrato baixo, o local de alta afinidade é ocupado e a cinética normal é seguida. Porém, em concentrações mais altas, o segundo sítio inibitório passa a ser ocupado, inibindo a enzima. A inibição do produto (seja o próprio produto da enzima ou um produto para uma enzima a jusante em sua via metabólica) é frequentemente uma característica reguladora do metabolismo e pode ser uma forma de feedback negativo .

Lento-apertado

A inibição lenta ocorre quando o complexo inicial enzima-inibidor EI sofre isomerismo conformacional (uma mudança na forma) para um segundo complexo mais firmemente mantido, EI*, mas o processo geral de inibição é reversível. Isso se manifesta como um aumento lento da inibição enzimática. Nestas condições, a cinética tradicional de Michaelis-Menten dá um valor falso para Ki , que é dependente do tempo. O verdadeiro valor de K i pode ser obtido por meio de análises mais complexas das constantes de velocidade on ( k on ) e off ( k off ) para associação do inibidor com cinética semelhante à inibição irreversível .

Análogos multi-substrato

TGDDF / GDDF MAIs onde o azul representa o análogo do cofator tetraidrofolato, o GAR ou tioGAR preto e o vermelho, os átomos de conexão.
Inibidor de aduto multi-substrato TGDDF/GDDF. Análogo de substrato em preto, análogo de cofator em azul, ligante não clivável em vermelho.
Ritonavir é semelhante ao substrato natural.
Ritonavir , inibidor da protease do HIV-1 baseado em peptídeo , com sítios de ligação ao substrato localizados na enzima marcada como S2, S1, S1' e S2'.
Tipranavir não é semelhante ao substrato natural.
Inibidor não peptídico da protease do HIV-1 tipranavir

Os inibidores análogos de múltiplos substratos são inibidores seletivos de alta afinidade que podem ser preparados para enzimas que catalisam reações com mais de um substrato, capturando a energia de ligação de cada um desses substratos em uma molécula. Por exemplo, nas reações de transferência de formil da biossíntese de purina , um potente inibidor de aduto multi-substrato (MAI) para glicinamida ribonucleotídeo (GAR) TFase foi preparado sinteticamente ligando análogos do substrato GAR e o cofator N-10-formil tetraidrofolato para produzir tioglicinamida ribonucleotídeo dideazafolato (TGDDF), ou enzimaticamente a partir do substrato GAR natural para produzir GDDF. Aqui, a constante de dissociação subnanomolar (KD) de TGDDF foi maior do que o previsto, presumivelmente devido às vantagens entrópicas obtidas e/ou interações positivas adquiridas através dos átomos que ligam os componentes. Observou-se também que MAIs são produzidos em células por reações de pró-drogas, como isoniazida ou ligantes inibidores de enzimas (por exemplo, PTC124 ) com cofatores celulares, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e adenosina trifosfato (ATP), respectivamente.

Exemplos

Como as enzimas evoluíram para se ligar fortemente a seus substratos, e a maioria dos inibidores reversíveis se ligam no sítio ativo das enzimas, não é surpreendente que alguns desses inibidores sejam surpreendentemente semelhantes em estrutura aos substratos de seus alvos. Os inibidores da dihidrofolato redutase (DHFR) são exemplos proeminentes. Outros exemplos desses imitadores de substrato são os inibidores de protease , uma classe terapeuticamente eficaz de medicamentos antirretrovirais usados ​​para tratar HIV/AIDS . A estrutura do ritonavir , um inibidor de protease peptidomimético (mímico de peptídeo) contendo três ligações peptídicas , conforme mostrado na figura "inibição competitiva" acima. Como essa droga se assemelha ao peptídeo que é o substrato da protease do HIV, ela compete com o substrato no sítio ativo da enzima.

Os inibidores enzimáticos são frequentemente projetados para imitar o estado de transição ou intermediário de uma reação catalisada por enzima. Isso garante que o inibidor explore o efeito estabilizador do estado de transição da enzima, resultando em uma melhor afinidade de ligação ( K i inferior ) do que os designs baseados em substrato. Um exemplo desse tipo de inibidor do estado de transição é o medicamento antiviral oseltamivir ; esta droga imita a natureza planar do íon oxônio do anel na reação da enzima viral neuraminidase .

No entanto, nem todos os inibidores são baseados nas estruturas dos substratos. Por exemplo, a estrutura de outro inibidor da protease do HIV, o tipranavir , não se baseia em um peptídeo e não possui similaridade estrutural óbvia com um substrato protéico. Esses inibidores não peptídicos podem ser mais estáveis ​​do que os inibidores contendo ligações peptídicas, porque não serão substratos para peptidases e têm menos probabilidade de serem degradados.

No planejamento de fármacos é importante considerar as concentrações dos substratos aos quais as enzimas-alvo são expostas. Por exemplo, alguns inibidores de proteína quinase têm estruturas químicas semelhantes ao ATP, um dos substratos dessas enzimas. No entanto, drogas que são inibidores competitivos simples terão que competir com as altas concentrações de ATP na célula. As proteínas quinases também podem ser inibidas pela competição nos locais de ligação onde as quinases interagem com suas proteínas substratos, e a maioria das proteínas está presente dentro das células em concentrações muito inferiores à concentração de ATP. Como consequência, se dois inibidores de proteína quinase se ligam no sítio ativo com afinidade semelhante, mas apenas um tem que competir com o ATP, então o inibidor competitivo no sítio de ligação da proteína inibirá a enzima de forma mais eficaz.

Inibidores irreversíveis

tipos

reação do DFP
Diagrama estrutural 2D representando um resíduo de aminoácido serina do sítio ativo da enzima formando uma ligação covalente com DFP deslocando o átomo de flúor
Reação do inibidor irreversível diisopropilfluorfosfato (DFP) com uma serina protease
Os inibidores irreversíveis ligam-se ao sítio de ligação da enzima e sofrem uma reação química para formar um complexo covalente enzima-inibidor (EI*). Local de ligação em azul, inibidor em verde.

Os inibidores irreversíveis ligam -se covalentemente a uma enzima e, portanto, esse tipo de inibição não pode ser prontamente revertido. Os inibidores irreversíveis geralmente contêm grupos funcionais reativos, como mostardas nitrogenadas , aldeídos , haloalcanos , alcenos , aceitadores de Michael , fenilsulfonatos ou fluorofosfonatos . Esses grupos eletrofílicos reagem com cadeias laterais de aminoácidos para formar adutos covalentes . Os resíduos modificados são aqueles com cadeias laterais contendo nucleófilos como grupos hidroxila ou sulfidrila ; estes incluem os aminoácidos serina (que reage com DFP , consulte o diagrama "reação DFP") e também cisteína , treonina ou tirosina .

A inibição irreversível é diferente da inativação enzimática irreversível. Os inibidores irreversíveis são geralmente específicos para uma classe de enzima e não inativam todas as proteínas; eles não funcionam destruindo a estrutura da proteína , mas alterando especificamente o sítio ativo de seu alvo. Por exemplo, extremos de pH ou temperatura geralmente causam desnaturação de toda a estrutura da proteína, mas este é um efeito não específico. Da mesma forma, alguns tratamentos químicos não específicos destroem a estrutura da proteína: por exemplo, o aquecimento em ácido clorídrico concentrado irá hidrolisar as ligações peptídicas que mantêm as proteínas unidas, liberando aminoácidos livres.

Os inibidores irreversíveis exibem inibição dependente do tempo e sua potência, portanto, não pode ser caracterizada por um valor de IC 50 . Isso ocorre porque a quantidade de enzima ativa em uma determinada concentração de inibidor irreversível será diferente, dependendo de quanto tempo o inibidor é pré-incubado com a enzima. Em vez disso, os valores de k obs /[ I ] são usados, onde k obs é a taxa de inativação de pseudoprimeira ordem observada (obtida plotando o logaritmo da % de atividade versus tempo) e [ I ] é a concentração do inibidor. O parâmetro k obs /[ I ] é válido desde que o inibidor não sature a ligação com a enzima (caso em que k obs = k inact ) onde k inact é a taxa de inativação.

Medindo

Mecanismo de inibição irreversível
Representação dos equilíbrios químicos reversíveis entre enzima + substrato, complexo enzima/substrato e enzima + produto, e dois equilíbrios concorrentes.  A primeira é entre enzima + inibidor, complexo não covalente enzima/inibidor, seguida da formação irreversível do complexo covalente.  A segunda é entre complexo enzima/substrato + inibidor, enzima/substrato não covalente, seguida da formação irreversível do complexo covalente
Mecanismo cinético para inibição irreversível. Ligação do substrato em azul, catálise em vermelho, ligação do inibidor em verde, reação de inativação em verde escuro.

Os inibidores irreversíveis primeiro formam um complexo não covalente reversível com a enzima (EI ou ESI). Subsequentemente, ocorre uma reação química entre a enzima e o inibidor para produzir o "complexo sem saída" modificado covalentemente EI* (um complexo covalente irreversível). A taxa na qual o EI* é formado é chamada de taxa de inativação ou kinact . Uma vez que a formação de EI pode competir com ES, a ligação de inibidores irreversíveis pode ser evitada pela competição com o substrato ou com um segundo inibidor reversível. Este efeito de proteção é uma boa evidência de uma reação específica do inibidor irreversível com o sítio ativo.

As etapas de ligação e inativação desta reação são investigadas incubando a enzima com o inibidor e ensaiando a quantidade de atividade remanescente ao longo do tempo. A atividade diminuirá de maneira dependente do tempo, geralmente seguindo o decaimento exponencial . O ajuste desses dados a uma equação de taxa fornece a taxa de inativação nessa concentração de inibidor. Isso é feito em várias concentrações diferentes de inibidor. Se um complexo EI reversível estiver envolvido, a taxa de inativação será saturável e ajustar esta curva dará k inact e K i .

Outro método amplamente utilizado nessas análises é a espectrometria de massas . Aqui, a medição precisa da massa da enzima nativa não modificada e da enzima inativada fornece o aumento de massa causado pela reação com o inibidor e mostra a estequiometria da reação. Isso geralmente é feito usando um espectrômetro de massa MALDI-TOF . Em uma técnica complementar, a impressão digital em massa de peptídeos envolve a digestão da proteína nativa e modificada com uma protease como a tripsina . Isso produzirá um conjunto de peptídeos que podem ser analisados ​​usando um espectrômetro de massa. O peptídeo que mudar de massa após a reação com o inibidor será aquele que contém o sítio de modificação.

Ligação lenta

Diagrama de estrutura química 2D representando um resíduo de lisina da enzima reagindo primeiro com DFMO, eliminação de flúor e dióxido de carbono, seguido por cisteína atacando o aduto covalente de lisina-DFMO, liberando o resíduo de lisina para formar um aduto de cisteína irreversível
Mecanismo químico para inibição irreversível da ornitina descarboxilase por DFMO. Piridoxal 5'-fosfato (Py) e enzima (E) não são mostrados. Adaptado de Poulin et al , 1992.

Nem todos os inibidores irreversíveis formam adutos covalentes com seus alvos enzimáticos. Alguns inibidores reversíveis ligam-se tão fortemente à sua enzima-alvo que são essencialmente irreversíveis. Esses inibidores de ligação forte podem mostrar cinética semelhante aos inibidores irreversíveis covalentes. Nesses casos, alguns desses inibidores se ligam rapidamente à enzima em um complexo EI de baixa afinidade e este sofre um rearranjo mais lento para um complexo EI* fortemente ligado (consulte o diagrama "mecanismo de inibição irreversível"). Esse comportamento cinético é chamado de ligação lenta. Esse rearranjo lento após a ligação geralmente envolve uma mudança conformacional à medida que a enzima "se prende" ao redor da molécula inibidora. Exemplos de inibidores de ligação lenta incluem alguns medicamentos importantes, como metotrexato , alopurinol e a forma ativada do aciclovir .

Alguns exemplos

Diagrama de desenho animado 3D da proteína tripanotiona redutase ligada a duas moléculas de inibidores representadas como diagramas de bastões.
Tripanotiona redutase com a molécula inferior de um inibidor ligada irreversivelmente e a superior reversivelmente. Criado a partir de Bond et al , 2004. ( PDB : 1GXF )

Diisopropilfluorofosfato (DFP) é um exemplo de um inibidor irreversível de protease (consulte o diagrama "reação DFP"). A enzima hidrolisa a ligação fósforo-flúor, mas o resíduo de fosfato permanece ligado à serina no sítio ativo , desativando-a. Da mesma forma, a DFP também reage com o sítio ativo da acetilcolina esterase nas sinapses dos neurônios e, consequentemente, é uma neurotoxina potente, com dose letal inferior a 100  mg.

A inibição suicida é um tipo incomum de inibição irreversível em que a enzima converte o inibidor em uma forma reativa em seu sítio ativo. Um exemplo é o inibidor da biossíntese de poliaminas , α-difluorometilornitina (DFMO), que é um análogo do aminoácido ornitina e é usado para tratar a tripanossomíase africana (doença do sono). A ornitina descarboxilase pode catalisar a descarboxilação do DFMO em vez da ornitina (consulte o diagrama do "mecanismo inibidor do DFMO"). No entanto, essa reação de descarboxilação é seguida pela eliminação de um átomo de flúor, que converte esse intermediário catalítico em uma imina conjugada , uma espécie altamente eletrofílica. Esta forma reativa de DFMO então reage com um resíduo de cisteína ou lisina no sítio ativo para inativar irreversivelmente a enzima.

Uma vez que a inibição irreversível geralmente envolve a formação inicial de um complexo não covalente de inibidor enzimático (EI), às vezes é possível que um inibidor se ligue a uma enzima de mais de uma maneira. Por exemplo, na figura que mostra a tripanotiona redutase do protozoário parasita humano Trypanosoma cruzi , duas moléculas de um inibidor chamado mostarda de quinacrina estão ligadas em seu sítio ativo. A molécula superior está ligada reversivelmente, mas a inferior está ligada covalentemente, pois reagiu com um resíduo de aminoácido por meio de seu grupo mostarda de nitrogênio .

Formulários

Os inibidores enzimáticos são encontrados na natureza e também produzidos artificialmente em laboratório. Os inibidores enzimáticos que ocorrem naturalmente regulam muitos processos metabólicos e são essenciais para a vida. Além disso, os venenos produzidos naturalmente são muitas vezes inibidores de enzimas que evoluíram para uso como agentes tóxicos contra predadores, presas e organismos concorrentes. Essas toxinas naturais incluem algumas das substâncias mais venenosas conhecidas. Os inibidores artificiais são frequentemente usados ​​como drogas, mas também podem ser inseticidas como o malation , herbicidas como o glifosato ou desinfetantes como o triclosan . Outros inibidores enzimáticos artificiais bloqueiam a acetilcolinesterase , uma enzima que decompõe a acetilcolina , e são usados ​​como agentes nervosos na guerra química .

Regulação metabólica

A inibição enzimática é uma característica comum do controle da via metabólica nas células. O fluxo metabólico através de uma via é muitas vezes regulado por metabólitos de uma via que atuam como inibidores e intensificadores para as enzimas nessa mesma via. A via glicolítica é um exemplo clássico. Esta via catabólica consome glicose e produz ATP , NADH e piruvato . Um passo fundamental para a regulação da glicólise é uma reação precoce na via catalisada pela fosfofrutoquinase‑1 (PFK1). Quando os níveis de ATP aumentam, o ATP se liga a um sítio alostérico em PFK1 para diminuir a velocidade da reação enzimática; a glicólise é inibida e a produção de ATP cai. Esse controle de feedback negativo ajuda a manter uma concentração constante de ATP na célula. No entanto, as vias metabólicas não são reguladas apenas por inibição, pois a ativação enzimática é igualmente importante. Com relação a PFK1, frutose 2,6-bifosfato e ADP são exemplos de metabólitos que são ativadores alostéricos.

A inibição enzimática fisiológica também pode ser produzida por inibidores de proteínas específicas. Esse mecanismo ocorre no pâncreas , que sintetiza muitas enzimas precursoras digestivas conhecidas como zimogênios . Muitos deles são ativados pela tripsina protease, por isso é importante inibir a atividade da tripsina no pâncreas para evitar que o órgão se digira. Uma maneira pela qual a atividade da tripsina é controlada é a produção de uma proteína inibidora de tripsina específica e potente no pâncreas. Este inibidor se liga fortemente à tripsina, impedindo a atividade da tripsina que, de outra forma, seria prejudicial ao órgão. Embora o inibidor de tripsina seja uma proteína, ele evita ser hidrolisado como substrato pela protease ao excluir a água do sítio ativo da tripsina e desestabilizar o estado de transição. Outros exemplos de proteínas inibidoras de enzimas fisiológicas incluem o inibidor barstar da ribonuclease barnase bacteriana .

venenos naturais

foto de três pilhas de sementes de leguminosas de cor marrom, verde ervilha e marrom/laranja
Para desencorajar a predação de sementes , as leguminosas contêm inibidores de tripsina que interferem na digestão.

Animais e plantas evoluíram para sintetizar uma vasta gama de produtos venenosos, incluindo metabólitos secundários , peptídeos e proteínas que podem atuar como inibidores. As toxinas naturais são geralmente pequenas moléculas orgânicas e são tão diversas que provavelmente existem inibidores naturais para a maioria dos processos metabólicos. Os processos metabólicos visados ​​pelos venenos naturais abrangem mais do que enzimas nas vias metabólicas e também podem incluir a inibição de receptores, canais e funções de proteínas estruturais em uma célula. Por exemplo, o paclitaxel (taxol), uma molécula orgânica encontrada no teixo do Pacífico , liga-se fortemente aos dímeros de tubulina e inibe sua montagem em microtúbulos no citoesqueleto .

Muitos venenos naturais atuam como neurotoxinas que podem causar paralisia levando à morte e funcionam na defesa contra predadores ou na caça e captura de presas. Alguns desses inibidores naturais, apesar de seus atributos tóxicos, são valiosos para usos terapêuticos em doses mais baixas. Um exemplo de neurotoxina são os glicoalcalóides , das espécies vegetais da família Solanaceae (inclui batata , tomate e berinjela ), que são inibidores da acetilcolinesterase . A inibição desta enzima causa um aumento descontrolado do neurotransmissor acetilcolina, paralisia muscular e, posteriormente, a morte. A neurotoxicidade também pode resultar da inibição de receptores; por exemplo, a atropina da beladona ( Atropa belladonna ) que funciona como um antagonista competitivo dos receptores muscarínicos de acetilcolina .

Embora muitas toxinas naturais sejam metabólitos secundários, esses venenos também incluem peptídeos e proteínas. Um exemplo de peptídeo tóxico é a alfa-amanitina , que é encontrada em parentes do cogumelo da tampa da morte . Este é um potente inibidor enzimático, neste caso impedindo a enzima RNA polimerase II de transcrever o DNA. A toxina de algas microcistina também é um peptídeo e é um inibidor de proteínas fosfatases . Esta toxina pode contaminar o abastecimento de água após a proliferação de algas e é um carcinógeno conhecido que também pode causar hemorragia hepática aguda e morte em doses mais altas.

As proteínas também podem ser venenos naturais ou antinutrientes , como os inibidores de tripsina (discutidos na seção "regulação metabólica" acima) que são encontrados em algumas leguminosas . Uma classe menos comum de toxinas são as enzimas tóxicas: elas agem como inibidores irreversíveis de suas enzimas-alvo e atuam modificando quimicamente suas enzimas substrato. Um exemplo é a ricina , uma toxina protéica extremamente potente encontrada na mamona . Essa enzima é uma glicosidase que inativa os ribossomos. Como a ricina é um inibidor catalítico irreversível, isso permite que apenas uma única molécula de ricina mate uma célula.

Drogas

Diagramas estruturais químicos 2D comparando ácido fólico e metotrexato
A coenzima ácido fólico (topo) em comparação com o medicamento anticancerígeno metotrexato (parte inferior)
Diagrama estrutural 2D do sildenafil
A estrutura do sildenafil (Viagra)

Os usos mais comuns dos inibidores enzimáticos são como medicamentos para tratar doenças. Muitos desses inibidores têm como alvo uma enzima humana e visam corrigir uma condição patológica. Por exemplo, a aspirina é uma droga amplamente utilizada que atua como um inibidor suicida da enzima ciclooxigenase . Essa inibição, por sua vez, suprime a produção de prostaglandinas pró-inflamatórias e, portanto, a aspirina pode ser usada para reduzir a dor, a febre e a inflamação.

A partir de 2017, cerca de 29% dos medicamentos aprovados são inibidores de enzimas, dos quais aproximadamente um quinto são inibidores de quinase . Uma classe notável de alvos de drogas quinase é o receptor tirosina quinase , que são enzimas essenciais que regulam o crescimento celular ; sua superativação pode resultar em câncer. Portanto, os inibidores da quinase, como o imatinibe , são frequentemente usados ​​para tratar doenças malignas. Janus quinases são outro exemplo notável de alvos enzimáticos de drogas. Os inibidores de Janus quinases bloqueiam a produção de citocinas inflamatórias e, portanto, esses inibidores são usados ​​para tratar uma variedade de doenças inflamatórias , incluindo artrite , asma e doença de Crohn .

Um exemplo da semelhança estrutural de alguns inibidores com os substratos das enzimas a que se dirigem é visto na figura comparando o fármaco metotrexato com o ácido fólico . O ácido fólico é a forma oxidada do substrato da dihidrofolato redutase , uma enzima fortemente inibida pelo metotrexato. O metotrexato bloqueia a ação da dihidrofolato redutase e, assim, interrompe a biossíntese da timidina . Este bloqueio da biossíntese de nucleotídeos é seletivamente tóxico para células de crescimento rápido, portanto, o metotrexato é frequentemente usado na quimioterapia do câncer.

Um tratamento comum para a disfunção erétil é o sildenafil (Viagra). Este composto é um potente inibidor da fosfodiesterase tipo 5 específica do cGMP , a enzima que degrada a molécula sinalizadora monofosfato de guanosina cíclica . Essa molécula sinalizadora desencadeia o relaxamento do músculo liso e permite o fluxo sanguíneo para o corpo cavernoso , o que causa uma ereção. Como a droga diminui a atividade da enzima que interrompe o sinal, ela faz com que esse sinal dure mais tempo.

antibióticos

Diagrama de desenho animado 3D da transpeptidase ligada à penicilina G representada como bastões
A estrutura de um complexo entre a penicilina  G e a transpeptidase de Streptomyces ( PDB : 1PWC ​)

Drogas também são usadas para inibir enzimas necessárias para a sobrevivência de patógenos. Por exemplo, as bactérias são cercadas por uma parede celular espessa feita de um polímero semelhante a uma rede chamado peptidoglicano . Muitos antibióticos , como a penicilina e a vancomicina , inibem as enzimas que produzem e, em seguida, reticulam as cadeias desse polímero. Isso faz com que a parede celular perca força e as bactérias explodam. Na figura, uma molécula de penicilina (mostrada na forma de bola e bastão) é mostrada ligada ao seu alvo, a transpeptidase da bactéria Streptomyces R61 (a proteína é mostrada como um diagrama em fita ).

O desenho de drogas antibióticas é facilitado quando uma enzima que é essencial para a sobrevivência do patógeno está ausente ou muito diferente em humanos. Os seres humanos não produzem peptidoglicano, portanto, os antibióticos que inibem esse processo são seletivamente tóxicos para as bactérias. A toxicidade seletiva também é produzida em antibióticos explorando diferenças na estrutura dos ribossomos em bactérias, ou como eles produzem ácidos graxos .

Antivirais

Drogas que inibem enzimas necessárias para a replicação de vírus são eficazes no tratamento de infecções virais. Os medicamentos antivirais incluem inibidores de protease usados ​​para tratar HIV/AIDS e hepatite C , inibidores da transcriptase reversa direcionados ao HIV/AIDS, inibidores da neuraminidase direcionados à gripe e inibidores da terminase direcionados ao citomegalovírus humano .

Pesticidas

Muitos pesticidas são inibidores de enzimas. A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima encontrada em animais, desde insetos até humanos. É essencial para o funcionamento das células nervosas através de seu mecanismo de quebra do neurotransmissor acetilcolina em seus constituintes, acetato e colina . Isso é um tanto incomum entre os neurotransmissores, pois a maioria, incluindo serotonina , dopamina e norepinefrina , é absorvida pela fenda sináptica em vez de clivada. Um grande número de inibidores de AChE é usado tanto na medicina quanto na agricultura. Inibidores competitivos reversíveis, como edrofônio , fisostigmina e neostigmina , são usados ​​no tratamento da miastenia gravis e na anestesia para reverter o bloqueio muscular. Os pesticidas carbamato também são exemplos de inibidores reversíveis da AChE. Os pesticidas organofosforados como malation , paration e clorpirifós inibem irreversivelmente a acetilcolinesterase.

Herbicidas

O herbicida glifosato é um inibidor da 3-fosfoshiquimato 1-carboxiviniltransferase , outros herbicidas, como as sulfoniluréias inibem a enzima acetolactato sintase . Ambas as enzimas são necessárias para que as plantas produzam aminoácidos de cadeia ramificada . Muitas outras enzimas são inibidas por herbicidas, incluindo enzimas necessárias para a biossíntese de lipídios e carotenóides e os processos de fotossíntese e fosforilação oxidativa .

Descoberta e design de inibidores

foto de robôs trabalhando
Os robôs são usados ​​para a triagem de alto rendimento de bibliotecas químicas para descobrir novos inibidores de enzimas.

Novas drogas são produtos de um longo processo de desenvolvimento de drogas , cujo primeiro passo é frequentemente a descoberta de um novo inibidor enzimático. Existem duas abordagens principais para descobrir esses inibidores.

O primeiro método geral é o planejamento racional de medicamentos baseado na imitação do estado de transição da reação química catalisada pela enzima. O inibidor projetado geralmente se assemelha ao substrato, exceto que a porção do substrato que sofre reação química é substituída por um grupo funcional quimicamente estável que se assemelha ao estado de transição. Uma vez que a enzima evoluiu para estabilizar o estado de transição, os análogos do estado de transição geralmente possuem maior afinidade pela enzima em comparação com o substrato e, portanto, são inibidores eficazes.

A segunda maneira de descobrir novos inibidores enzimáticos é a triagem de alto rendimento de grandes bibliotecas de compostos estruturalmente diversos para identificar moléculas de sucesso que se ligam à enzima. Este método foi estendido para incluir a triagem virtual de bancos de dados de diversas moléculas usando computadores, que são seguidas pela confirmação experimental da ligação dos resultados da triagem virtual. Abordagens complementares que podem fornecer novos pontos de partida para inibidores incluem descoberta de chumbo baseada em fragmentos e Bibliotecas Químicas Codificadas de DNA (DEL).

Acertos de qualquer uma das abordagens acima podem ser otimizados para ligantes de alta afinidade que inibem eficientemente a enzima. Métodos baseados em computador para prever a orientação de ligação e afinidade de um inibidor para uma enzima, como docking molecular e mecânica molecular , podem ser usados ​​para auxiliar no processo de otimização. Novos inibidores são usados ​​para obter estruturas cristalográficas da enzima em um complexo inibidor/enzima para mostrar como a molécula está se ligando ao sítio ativo, permitindo que alterações sejam feitas no inibidor para otimizar a ligação em um processo conhecido como design de drogas baseado em estrutura . Este ciclo de teste e melhoria é repetido até que seja produzido um inibidor suficientemente potente.

Veja também

Referências

links externos

  • "BRENDA" . Arquivado do original em 1º de abril de 2022., Banco de dados de enzimas com listas de inibidores conhecidos para cada entrada
  • "PubChem" . Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia . Biblioteca Nacional de Medicina.Banco de dados de drogas e inibidores enzimáticos
  • "Simbolismo e terminologia em cinética enzimática" . Arquivado do original em 20 de junho de 2006.Recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica (NC-IUB) sobre a terminologia de inibição enzimática