Etanol precipitação - Ethanol precipitation

Precipitação com etanol é um método usado para purificar e / ou concentrar o ARN , ADN , e polissacáridos tais como pectina e xiloglucano de soluções aquosas por adição de etanol como um anti-solvente.

a precipitação do DNA

Teoria

A primeira camada de hidratação de um ião de sódio dissolvido em água

ADN é polar devido à sua carga elevada de fosfato de espinha dorsal. A sua polaridade faz com que seja solúvel em água (a água é polar) de acordo com o princípio "como se dissolve como" .

Por causa da elevada polaridade da água, ilustrado pela sua alta constante dieléctrica de 80,1 (a 20 ° C), as forças electrostáticas entre partículas carregadas são consideravelmente mais baixas em solução aquosa do que em um vácuo ou em ar.

Esta relação é reflectida na lei de Coulomb , que pode ser usado para calcular a força que actua sobre duas cargas e separados por uma distância utilizando a constante dieléctrica (também chamado permissividade estática relativa) do meio, no denominador da equação ( é um elétrico constante ): ${\ Displaystyle Q_ {1}}$${\ Displaystyle Q_ {2}}$${\ Displaystyle r}$${\ Displaystyle \ epsilon _ {r}}$${\ Displaystyle \ epsilon _ {0}}$

${\ Displaystyle F = {\ frac {1} {4 \ pi \ epsilon _ {r} \ epsilon _ {0}}} {\ frac {q_ {1} q_ {2}} {r ^ {2}}} }$

A um nível atómico, a redução na força que actua sobre uma carga resultados de moléculas de água que formam uma camada de hidratação ao redor dela. Este facto faz com que a água um solvente muito bom para compostos carregados como sais. Força eléctrica, que normalmente prende o sal cristais em conjunto por meio de ligações iónicas é enfraquecida na presença de água permitindo que os iões para separar a partir do cristal e distribuídos através de uma solução.

O mesmo mecanismo opera no caso de grupos fosfato carregados negativamente sobre um esqueleto de ADN: apesar dos iões positivos estarem presentes em solução, a força electrostática líquida relativamente fraca impede-as de formar ligações iónicas estáveis com fosfatos e precipitar para fora da solução.

Etanol é muito menos polares do que a água, com uma constante dieltrica de 24,3 (a 25 ° C). Isto significa que a adição de etanol à solução perturba o rastreio de cargas por água. Se etanol suficiente é adicionada, a atracção eléctrica entre os grupos de fosfato e os iões positivos presentes na solução se torna suficientemente forte para formar estáveis ligações iónicas e precipitação do DNA. Isto acontece geralmente quando etanol compõe mais de 64% da solução. À medida que o mecanismo sugere, a solução tem de conter iões positivos para a precipitação a ocorrer; geralmente de Na ⁺ , NH ₄ ⁺ ou Li ⁺ desempenha este papel.

Prática

Uma centrifugadora de laboratório mesa

O DNA é precipitado pela primeira assegurando que a concentração correcta de iões positivos está presente em solução (demais resultará em uma grande quantidade de sal de co-precipitação com ADN, demasiado pequena resultará na recuperação de ADN incompleta) e depois adição de dois a três volumes de pelo menos 95% de etanol. Muitos protocolos aconselham armazenar ADN a baixa temperatura, neste ponto, mas há também a observação de que não podem melhorar a recuperação do ADN, e podem até mesmo menor eficiência de precipitação durante a utilização durante a noite tempo de incubação. Portanto, uma boa eficiência pode ser conseguida à temperatura ambiente, mas, quando possível, a degradação é tomada em consideração, é, provavelmente, melhor a incubar de ADN em gelo húmido. Tempo de incubação óptimo depende do comprimento e a concentração de ADN. Os fragmentos mais pequenos e concentrações mais baixas requerem tempos mais longos para conseguir a recuperação aceitável. Para pequenos comprimentos e muito baixas concentrações ao longo da noite de incubação é recomendado. Em tais casos, usar de operadoras como tRNA , glicogênio ou linear de poliacrilamida pode melhorar significativamente a recuperação.

Durante a incubação do ADN e alguns sais precipitam a partir da solução, no passo seguinte deste precipitado é recolhido por centrifugação num tubo de microcentrifuga a velocidades elevadas (~ 12000 g ). Tempo e velocidade de centrifugação tem o maior efeito sobre as taxas de recuperação de DNA. Novamente fragmentos mais pequenos e diluições mais elevadas exigem mais tempo e mais rápida centrifugação. A centrifugação pode ser feito quer à temperatura ambiente ou em 4 ° C ou a 0 ° C. Durante a centrifugação, precipitou o DNA tem de se mover através de uma solução de etanol para o fundo do tubo, as temperaturas mais baixas aumentam a viscosidade da solução e os volumes maiores tornam a distância mais longa, de modo que ambos estes elementos baixa eficiência deste processo que exige mais tempo de centrifugação para o mesmo efeito. Após a centrifugação da solução sobrenadante é removido, deixando um pelete de ADN em bruto. Se o sedimento é visível depende da quantidade de ADN e da sua pureza (peletes mais sujas são mais fáceis para ver) ou o uso de co-precipitantes.

No passo seguinte, de 70% de etanol é adicionado ao sedimento, e é suavemente misturada a quebrar o sedimento solto e lavá-la. Isto remove alguns dos sais presentes no sobrenadante restante e obrigado a pelota de ADN tornando o líquido de limpeza final de ADN. Esta suspensão é centrifugada de novo a pelota uma vez novamente o ADN e a solução sobrenadante é removido. Este passo é repetido uma vez.

Finalmente, o sedimento é seco ao ar e o ADN foi ressuspenso em água ou outro desejado tampão . É importante não over-secar o sedimento, pois pode levar a desnaturação de DNA e tornar mais difícil para voltar a suspender.

Isopropanol também pode ser utilizado em vez de etanol; a eficiência de precipitação do isopropanol é maior tornando um volume suficiente para a precipitação. No entanto, o isopropanol é menos volátil do que o etanol e precisa de mais tempo a secar ao ar no passo final. A pelete pode também aderem menos fortemente ao tubo quando se utiliza isopropanol.

Veja também

• extracção de ADN
• extracção com fenol-clorofórmio
• salga em
• salga fora
• purificação de ADN Scoda
• purificação de ácidos nucleicos com base em coluna de spin

Referências

links externos

• bitesizebio.com O básico: Como Etanol precipitação de DNA e RNA Works
• Zeugin JA, Hartley JL (1985). "O etanol precipitação de DNA" (PDF) . Concentre-se . 7 (4): 1-2 . Retirado 2008-09-10 .
• Crouse J, Amorese D (1987). "O etanol Precipitação: acetato de amónio como uma alternativa para Acetato de sódio" (PDF) . Concentre-se . 9 (2): 3-5. Arquivado do original (PDF) em 2009-11-22 . Retirado 2008-09-10 .