Hibridização fluorescente in situ -Fluorescence in situ hybridization

Visualização de RNA multiplex em células usando ensaios ViewRNA FISH
Uma célula metafásica positiva para o rearranjo bcr / abl (associado à leucemia mielóide crônica ) usando FISH. Os cromossomos podem ser vistos em azul. O cromossomo marcado com manchas verdes e vermelhas (canto superior esquerdo) é aquele onde o rearranjo está presente.

A hibridização fluorescente in situ ( FISH ) é uma técnica de citogenética molecular que usa sondas fluorescentes que se ligam a apenas partes específicas de uma sequência de ácido nucleico com um alto grau de complementaridade de sequência . Foi desenvolvido por pesquisadores biomédicos no início dos anos 1980 para detectar e localizar a presença ou ausência de sequências específicas de DNA nos cromossomos . A microscopia de fluorescência pode ser usada para descobrir onde a sonda fluorescente está ligada aos cromossomos. FISH é freqüentemente usado para encontrar características específicas no DNA para uso em aconselhamento genético , medicina e identificação de espécies. FISH também pode ser usado para detectar e localizar alvos específicos de RNA ( mRNA , lncRNA e miRNA ) em células, células tumorais circulantes e amostras de tecido. Nesse contexto, pode ajudar a definir os padrões espaço-temporais da expressão gênica em células e tecidos.

Sondas - RNA e DNA

Detecção de ViewRNA de miR-133 (verde) e mRNA de miogenina (vermelho) em células diferenciadoras de C2C12

Em biologia, uma sonda é uma única fita de DNA ou RNA que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de interesse.

As sondas de RNA podem ser projetadas para qualquer gene ou qualquer sequência dentro de um gene para visualização de mRNA , lncRNA e miRNA em tecidos e células. FISH é usado examinando o ciclo de reprodução celular, especificamente interfase dos núcleos para quaisquer anomalias cromossômicas. O FISH permite a análise de uma grande série de casos arquivados com muito mais facilidade para identificar o cromossomo localizado, criando uma sonda com uma base cromossômica artificial que atrairá cromossomos semelhantes. Os sinais de hibridização para cada sonda quando uma anormalidade nucleica é detectada. Cada sonda para a detecção de mRNA e lncRNA é composta de ~ 20-50 pares de oligonucleotídeos, cada par cobrindo um espaço de 40-50 bp. As especificações dependem da técnica de FISH específica usada. Para detecção de miRNA, as sondas usam química proprietária para detecção específica de miRNA e cobrem toda a sequência de miRNA.

Células uroteliais marcadas com quatro sondas diferentes

As sondas são freqüentemente derivadas de fragmentos de DNA que foram isolados, purificados e amplificados para uso no Projeto Genoma Humano . O tamanho do genoma humano é tão grande, comparado ao comprimento que poderia ser sequenciado diretamente, que foi necessário dividir o genoma em fragmentos. (Na eventual análise, esses fragmentos foram colocados em ordem digerindo uma cópia de cada fragmento em fragmentos ainda menores usando endonucleases específicas de sequência, medindo o tamanho de cada pequeno fragmento usando cromatografia de exclusão de tamanho e usando essa informação para determinar onde o grandes fragmentos se sobrepunham.) Para preservar os fragmentos com suas sequências de DNA individuais, os fragmentos foram adicionados a um sistema de populações de bactérias em replicação contínua. Populações clonais de bactérias, cada população mantendo um único cromossomo artificial, são armazenadas em vários laboratórios ao redor do mundo. Os cromossomos artificiais ( BAC ) podem ser cultivados, extraídos e rotulados em qualquer laboratório que contenha uma biblioteca. As bibliotecas genômicas costumam ter o nome da instituição na qual foram desenvolvidas. Um exemplo é a biblioteca RPCI-11, que leva o nome de Roswell Park Comprehensive Cancer Center (anteriormente conhecido como Roswell Park Cancer Institute) em Buffalo, Nova York . Esses fragmentos são da ordem de 100 mil pares de bases e são a base para a maioria das sondas FISH.

Processo de preparação e hibridização - RNA

Células, células tumorais circulantes (CTCs) ou seções de tecido congelado fixadas em formalina (FFPE) ou congeladas são fixadas e, em seguida, permeabilizadas para permitir acessibilidade ao alvo. A FISH também foi realizada com sucesso em células não fixadas. Uma sonda específica para o alvo, composta por 20 pares de oligonucleotídeos, hibridiza com o (s) RNA (s) alvo. Sistemas de amplificação de sinal separados, mas compatíveis, permitem o ensaio multiplex (até dois alvos por ensaio). A amplificação do sinal é obtida por meio de uma série de etapas sequenciais de hibridização. No final do ensaio, as amostras de tecido são visualizadas em um microscópio de fluorescência.

Processo de preparação e hibridização - DNA

Esquema do princípio da Experiência FISH para localizar um gene no núcleo.

Primeiro, uma sonda é construída. A sonda deve ser grande o suficiente para hibridizar especificamente com seu alvo, mas não tão grande a ponto de impedir o processo de hibridização. A sonda é marcada diretamente com fluoróforos , com alvos para anticorpos ou com biotina . A marcação pode ser feita de várias maneiras, como tradução de corte ou reação em cadeia da polimerase usando nucleotídeos marcados .

Em seguida, uma preparação cromossômica em interfase ou metáfase é produzida. Os cromossomos estão firmemente presos a um substrato , geralmente de vidro. As sequências repetitivas de DNA devem ser bloqueadas pela adição de pequenos fragmentos de DNA à amostra. A sonda é então aplicada ao DNA do cromossomo e incubada por aproximadamente 12 horas durante a hibridização. Vários passos de lavagem removem todas as sondas não hibridizadas ou parcialmente hibridizadas. Os resultados são então visualizados e quantificados por meio de um microscópio capaz de excitar o corante e registrar as imagens.

Se o sinal fluorescente for fraco, a amplificação do sinal pode ser necessária para exceder o limite de detecção do microscópio . A intensidade do sinal fluorescente depende de muitos fatores, como a eficiência da marcação da sonda, o tipo de sonda e o tipo de corante. Anticorpos marcados com fluorescência ou estreptavidina são ligados à molécula do corante. Esses componentes secundários são selecionados para que tenham um sinal forte.

Variações nas sondas e análises

FISH é uma técnica muito geral. As diferenças entre as várias técnicas de FISH são geralmente devidas a variações na sequência e marcação das sondas; e como eles são usados ​​em combinação. As sondas são divididas em duas categorias genéricas: celulares e acelulares. A hibridização fluorescente "in situ" refere-se à colocação celular da sonda

O tamanho da sonda é importante porque as sondas mais longas hibridizam menos especificamente do que as sondas mais curtas, de modo que fitas curtas de DNA ou RNA (frequentemente 10-25 nucleotídeos) que são complementares a uma determinada sequência alvo são freqüentemente usadas para localizar um alvo. A sobreposição define a resolução dos recursos detectáveis. Por exemplo, se o objetivo de um experimento é detectar o ponto de interrupção de uma translocação , então a sobreposição das sondas - o grau em que uma sequência de DNA está contida nas sondas adjacentes - define a janela mínima na qual o ponto de interrupção pode ser detectado .

A mistura de sequências de sonda determina o tipo de recurso que a sonda pode detectar. As sondas que hibridizam ao longo de um cromossomo inteiro são usadas para contar o número de um determinado cromossomo, mostrar translocações ou identificar fragmentos extra-cromossômicos de cromatina . Isso geralmente é chamado de "pintura de cromossomos inteiros". Se cada sonda possível for usada, cada cromossomo (todo o genoma) seria marcado por fluorescência, o que não seria particularmente útil para determinar características de sequências individuais. No entanto, é possível criar uma mistura de sondas menores que são específicas para uma determinada região (locus) do DNA; essas misturas são usadas para detectar mutações de deleção . Quando combinada com uma cor específica, uma mistura de sonda específica de locus é usada para detectar translocações muito específicas. Misturas de sondas específicas de locus especiais são frequentemente usadas para contar cromossomos, ligando-se às regiões centroméricas dos cromossomos, que são distintas o suficiente para identificar cada cromossomo (com exceção do cromossomo 13 , 14 , 21 , 22 ).

Uma variedade de outras técnicas usa misturas de sondas de cores diferentes. Uma gama de cores em misturas de corantes fluorescentes pode ser detectada, de modo que cada cromossomo humano pode ser identificado por uma cor característica usando misturas de sondas de cromossomo inteiro e uma variedade de proporções de cores. Embora haja mais cromossomos do que cores fluorescentes facilmente distinguíveis, as proporções das misturas de sondas podem ser usadas para criar cores secundárias . Semelhante à hibridização genômica comparativa , a mistura de sondas para as cores secundárias é criada pela mistura da proporção correta de dois conjuntos de sondas de cores diferentes para o mesmo cromossomo. Esta técnica é às vezes chamada de M-FISH.

A mesma física que possibilita uma variedade de cores para o M-FISH pode ser usada para a detecção de translocações. Ou seja, as cores adjacentes parecem se sobrepor; uma cor secundária é observada. Alguns ensaios são projetados de forma que a cor secundária esteja presente ou ausente em casos de interesse. Um exemplo é a detecção de translocações BCR / ABL , onde a cor secundária indica doença. Esta variação é freqüentemente chamada de FISH de fusão dupla ou D-FISH. Na situação oposta - onde a ausência da cor secundária é patológica - é ilustrado por um ensaio usado para investigar translocações onde apenas um dos pontos de quebra é conhecido ou constante. As sondas específicas do locus são feitas para um lado do ponto de interrupção e o outro cromossomo intacto. Em células normais, a cor secundária é observada, mas apenas as cores primárias são observadas quando ocorre a translocação. Esta técnica é às vezes chamada de "break-apart FISH".

FISH de RNA de molécula única

O RNA FISH de molécula única, também conhecido como Stellaris® RNA FISH, é um método de detecção e quantificação de mRNA e outras moléculas de RNA longas em uma camada fina de amostra de tecido. Os alvos podem ser visualizados com segurança através da aplicação de múltiplas sondas oligonucleotídicas curtas e marcadas individualmente . A ligação de até 48 oligos marcados com fluorescência a uma única molécula de mRNA fornece fluorescência suficiente para detectar e localizar com precisão cada mRNA alvo em uma imagem de microscopia fluorescente de campo amplo . As sondas que não se ligam à sequência pretendida não atingem fluorescência localizada suficiente para serem distinguidas do fundo .

Os ensaios de FISH de RNA de molécula única podem ser realizados em simplex ou multiplex e podem ser usados ​​como um experimento de acompanhamento para PCR quantitativo , ou imageados simultaneamente com um ensaio de anticorpo fluorescente . A tecnologia tem aplicações potenciais no diagnóstico de câncer , neurociência , análise de expressão gênica e diagnóstico de companheirismo .

Fibra FISH

Em uma técnica alternativa para preparações de interfase ou metáfase, fibra FISH, cromossomos interfásicos são anexados a uma lâmina de tal forma que eles são esticados em uma linha reta, ao invés de serem enrolados firmemente, como no FISH convencional, ou adotando um território cromossômico conformação, como na interfase FISH. Isso é realizado aplicando cisalhamento mecânico ao longo do comprimento da lâmina, seja em células que foram fixadas na lâmina e depois lisadas , ou em uma solução de DNA purificado. Uma técnica conhecida como penteação cromossômica é cada vez mais usada para esse fim. A conformação estendida dos cromossomos permite uma resolução dramaticamente maior - mesmo em alguns quilobases . A preparação de amostras de fibra FISH, embora conceitualmente simples, é uma arte bastante habilidosa, e apenas laboratórios especializados usam a técnica rotineiramente.

Q-FISH

Q-FISH combina FISH com PNAs e software de computador para quantificar a intensidade de fluorescência. Esta técnica é usada rotineiramente em pesquisas de comprimento de telômeros .

Flow-FISH

O Flow-FISH usa citometria de fluxo para realizar FISH automaticamente usando medições de fluorescência por célula.

MA-FISH

FISH assistido por microfluídicos ( MA-FISH ) usa um fluxo microfluídico para aumentar a eficiência de hibridização de DNA, diminuindo o caro consumo da sonda FISH e reduzindo o tempo de hibridização. MA-FISH é aplicado para detectar o gene HER2 em tecidos de câncer de mama.

MAR-FISH

Microautoradiografia FISH é uma técnica para combinar substratos marcados com rádio com FISH convencional para detectar grupos filogenéticos e atividades metabólicas simultaneamente.

Hybrid Fusion-FISH

Hybrid Fusion FISH ( HF-FISH ) usa combinação de excitação / emissão de aditivos primários de fluoróforos para gerar espectros adicionais por meio de um processo de marcação conhecido como transmissão óptica dinâmica (DOT). Três fluoróforos primários são capazes de gerar um total de 7 espectros de emissão prontamente detectáveis ​​como resultado da marcação combinatória usando DOT. Hybrid Fusion FISH permite aplicações FISH altamente multiplexadas que são direcionadas a painéis de oncologia clínica. A tecnologia oferece pontuação mais rápida com conjuntos de sondas eficientes que podem ser facilmente detectados com microscópios fluorescentes tradicionais.

Aplicações médicas

Freqüentemente, os pais de crianças com deficiência de desenvolvimento desejam saber mais sobre as condições de seus filhos antes de decidirem ter outro filho. Essas preocupações podem ser tratadas por meio da análise do DNA dos pais e da criança. Nos casos em que a deficiência de desenvolvimento da criança não é compreendida, a causa pode ser determinada usando FISH e técnicas citogenéticas . Exemplos de doenças que são diagnosticadas usando FISH incluem síndrome de Prader-Willi , síndrome de Angelman , 22q13 síndrome de deleção , leucemia mielóide crônica , leucemia linfoblástica aguda , Cri-du-chat , síndrome Velocardiofacial , e síndrome de Down . FISH em células espermáticas é indicado para homens com um cariótipo somático ou meiótico anormal , bem como aqueles com oligozoospermia , uma vez que aproximadamente 50% dos homens oligozoospérmicos têm uma taxa aumentada de anormalidades cromossômicas espermáticas. A análise dos cromossomos 21, X e Y é suficiente para identificar indivíduos oligozoospérmicos em risco.

Na medicina, o FISH pode ser usado para formar um diagnóstico , para avaliar o prognóstico ou para avaliar a remissão de uma doença, como o câncer . O tratamento pode então ser especificamente adaptado. Um exame tradicional envolvendo a análise cromossômica metafásica geralmente é incapaz de identificar características que distinguem uma doença de outra, devido a características cromossômicas sutis; FISH pode elucidar essas diferenças. O FISH também pode ser usado para detectar células doentes mais facilmente do que os métodos citogenéticos padrão , que exigem a divisão das células e requerem trabalho e preparação manual demorada e análise das lâminas por um técnico. O FISH, por outro lado, não requer células vivas e pode ser quantificado automaticamente, um computador conta os pontos fluorescentes presentes. No entanto, um tecnólogo treinado é necessário para distinguir diferenças sutis nos padrões de bandas em cromossomos metáfases curvados e torcidos. O FISH pode ser incorporado ao dispositivo microfluídico Lab-on-a-chip . Esta tecnologia ainda está em um estágio de desenvolvimento, mas, como outros métodos de laboratório em um chip, pode levar a técnicas de diagnóstico mais portáteis.

Esta figura descreve o processo de hibridização fluorescente in situ (FISH) usado para identificação de patógenos.  Primeiro, uma amostra do tecido infectado é retirada do paciente.  Em seguida, um oligonucleotídeo que é complementar ao código genético do patógeno suspeito é sintetizado e quimicamente marcado com uma sonda fluorescente.  A amostra de tecido coletada deve então ser tratada quimicamente para tornar as membranas celulares permeáveis ​​ao oligonucleotídeo marcado com fluorescência.  Depois que a amostra de tecido é tratada, o oligonucleotídeo complementar marcado é adicionado.  O oligonucleotídeo marcado com fluorescência só se ligará ao DNA complementar do patógeno suspeito.  Se o patógeno estiver presente na amostra de tecido, as células do patógeno brilharão / fluorescem após o tratamento com o oligonucleotídeo marcado.  Todas as outras células não brilharão após o tratamento.
Processo geral de hibridização fluorescente in situ (FISH) usado para identificação de patógenos bacterianos. Primeiro, uma amostra de tecido infectado é retirada do paciente. Em seguida, um oligonucleotídeo complementar ao código genético do patógeno suspeito é sintetizado e quimicamente marcado com uma sonda fluorescente. A amostra de tecido é tratada quimicamente para tornar as membranas celulares permeáveis ​​ao oligonucleotídeo marcado com fluorescência. A etiqueta fluorescente é então adicionada e se liga apenas ao DNA complementar do patógeno suspeito. Se o patógeno estiver presente na amostra de tecido, as células do patógeno ficarão fluorescentes após o tratamento com o oligonucleotídeo marcado. Nenhuma outra célula brilhará.

Identificação de espécies

A FISH tem sido amplamente estudada como técnica de diagnóstico para a identificação de patógenos no campo da microbiologia médica. Embora tenha se mostrado uma técnica útil e aplicável, ainda não é amplamente aplicada em laboratórios de diagnóstico. O curto tempo para o diagnóstico (menos de 2 horas) tem sido uma grande vantagem em comparação com a diferenciação bioquímica, mas essa vantagem é desafiada pelo MALDI-TOF-MS, que permite a identificação de uma gama mais ampla de patógenos em comparação com as técnicas de diferenciação bioquímica. O uso de FISH para fins diagnósticos encontrou seu propósito quando a identificação imediata das espécies é necessária, especificamente para a investigação de hemoculturas para as quais FISH é uma técnica barata e fácil para um diagnóstico rápido preliminar.

FISH também pode ser usado para comparar os genomas de duas espécies biológicas , para deduzir relações evolutivas . Uma técnica de hibridização semelhante é chamada de zoo blot . As sondas FISH bacterianas são frequentemente iniciadores para a região 16s rRNA .

O FISH é amplamente utilizado no campo da ecologia microbiana , para identificar microorganismos . Os biofilmes , por exemplo, são compostos de organizações bacterianas complexas (frequentemente) de várias espécies. Preparar sondas de DNA para uma espécie e realizar FISH com esta sonda permite visualizar a distribuição desta espécie específica dentro do biofilme. A preparação de sondas (em duas cores diferentes) para duas espécies permite aos pesquisadores visualizar / estudar a co-localização dessas duas espécies no biofilme e pode ser útil na determinação da arquitetura fina do biofilme.

Hibridização genômica comparativa

A hibridização genômica comparativa pode ser descrita como um método que usa FISH de uma maneira paralela com a comparação da força de hibridização para relembrar quaisquer interrupções importantes no processo de duplicação das sequências de DNA no genoma do núcleo.

Cariótipo virtual

O cariótipo virtual é outra alternativa econômica e clinicamente disponível aos painéis FISH, usando milhares a milhões de sondas em uma única matriz para detectar alterações no número de cópias, em todo o genoma, em resolução sem precedentes. Atualmente, esse tipo de análise detectará apenas ganhos e perdas de material cromossômico e não detectará rearranjos balanceados, como translocações e inversões, que são aberrações marcantes vistas em muitos tipos de leucemia e linfoma.

Cariótipo espectral

O cariótipo espectral é uma imagem de cromossomos coloridos. O cariótipo espectral envolve FISH usando várias formas de muitos tipos de sondas com o resultado de ver cada cromossomo marcado em seu estágio de metáfase. Este tipo de cariótipo é usado especificamente ao buscar arranjos cromossômicos.

Veja também

Galeria

Referências

Leitura adicional

links externos