G-quadruplex - G-quadruplex

Estrutura de um G-quadruplex. Esquerda: um G-tétrade. À direita: um complexo G4 intramolecular.

Em biologia molecular, as estruturas secundárias do quadruplex G (G4) são formadas em ácidos nucléicos por sequências ricas em guanina . Eles têm forma helicoidal e contêm tétrades de guanina que podem se formar a partir de um, dois ou quatro fios. As formas unimoleculares freqüentemente ocorrem naturalmente perto das extremidades dos cromossomos, mais conhecidas como regiões teloméricas, e em regiões regulatórias da transcrição de vários genes, tanto em micróbios quanto em vertebrados, incluindo oncogenes em humanos. Quatro bases de guanina podem se associar por meio de ligações de hidrogênio Hoogsteen para formar uma estrutura quadrada plana chamada tétrade de guanina (G-tétrade ou G-quarteto), e duas ou mais tétrades de guanina (de tratos G, séries contínuas de guanina) podem se empilhar no topo um do outro para formar um G-quadruplex.

A colocação e ligação para formar G-quadruplex não é aleatória e serve a propósitos funcionais muito incomuns. A estrutura quádrupla é ainda mais estabilizada pela presença de um cátion , especialmente potássio , que fica em um canal central entre cada par de tétrades. Eles podem ser formados de DNA , RNA , LNA e PNA e podem ser intramoleculares , bimoleculares ou tetramoleculares. Dependendo da direção dos fios ou partes de um fio que formam as tétrades, as estruturas podem ser descritas como paralelas ou antiparalelas . Estruturas G-quadruplex podem ser previstas computacionalmente a partir de motivos de sequências de DNA ou RNA, mas suas estruturas reais podem ser bastante variadas dentro e entre os motivos, que podem chegar a mais de 100.000 por genoma. Suas atividades em processos genéticos básicos são uma área ativa de pesquisa em telômeros, regulação de genes e pesquisa genômica funcional.

História

A identificação de estruturas com alta associação guanina tornou-se aparente no início dos anos 1960, por meio da identificação de substâncias gelatinosas associadas às guaninas. Mais especificamente, esta pesquisa detalhou as estruturas de quatro fitas do DNA com uma alta associação de guaninas, que foi posteriormente identificado em regiões teloméricas eucarióticas do DNA na década de 1980. A importância de descobrir a estrutura G-quadruplex foi descrita através da declaração, “Se G-quadruplexes se formam tão facilmente in vitro , a Natureza terá encontrado uma maneira de usá-los in vivo ” - Aaron Klug , Vencedor do Prêmio Nobel em Química (1982). O interesse na função in vivo de G-quadruplexes aumentou após a análise em larga escala do genoma mostrou a prevalência de potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (pG4) em promotores de genes de humanos, chimpanzés, camundongos e ratos - apresentados no First International G -quadruplex Meeting realizado em abril de 2007 em Louisville, Kentucky. Em 2006, a prevalência de G-quadruplexes dentro de promotores de genes de vários genomas bacterianos foi relatada, prevendo a regulação gênica mediada por G-quadruplex. Com a abundância de G-quadruplexes in vivo , essas estruturas desempenham um papel biologicamente relevante por meio de interações com as regiões promotoras dos oncogenes e as regiões teloméricas das fitas de DNA. A pesquisa atual consiste em identificar a função biológica dessas estruturas G-quadruplex para oncogenes específicos e descobrir tratamentos terapêuticos eficazes para o câncer com base em interações com G-quadruplexes.

Estrutura 3D do G-quadruplex telomérico intramolecular humano em solução de potássio. O backbone é representado por um tubo. O centro desta estrutura contém três camadas de tétrades G. As ligações de hidrogênio nessas camadas são representadas por linhas tracejadas em azul. ( PDB : 2HY9 )

Topologia

O comprimento das sequências de ácido nucleico envolvidas na formação da tétrade determina como o quadruplex se dobra. Seqüências curtas, consistindo em apenas uma única execução contígua de três ou mais bases guanina, requerem quatro fitas individuais para formar um quádruplo. Esse quádruplo é descrito como tetramolecular, refletindo a necessidade de quatro fios separados. O termo DNA G4 foi originalmente reservado para essas estruturas tetramoleculares que podem desempenhar um papel na meiose . No entanto, como usado atualmente em biologia molecular, o termo G4 pode significar G-quadruplexes de qualquer molecularidade. Sequências mais longas, que contêm duas sequências contíguas de três ou mais bases guanina, onde as regiões guanina são separadas por uma ou mais bases, requerem apenas duas dessas sequências para fornecer bases guanina suficientes para formar um quádruplo. Essas estruturas, formadas por duas fitas separadas ricas em G, são denominadas quádruplos bimoleculares. Finalmente, as sequências que contêm quatro séries distintas de bases de guanina podem formar estruturas quádruplas estáveis ​​por si mesmas, e um quádruplo formado inteiramente de uma única fita é chamado de quádruplo intramolecular.

Dependendo de como as execuções individuais de bases de guanina são organizadas em um quádruplo bimolecular ou intramolecular, um quádruplo pode adotar uma de uma série de topologias com configurações de loop variáveis. Se todas as fitas de DNA procedem na mesma direção, o quadruplex é denominado paralelo. Para quádruplos intramoleculares, isso significa que quaisquer regiões de loop presentes devem ser do tipo hélice, posicionadas nas laterais do quádruplo. Se uma ou mais das séries de bases guanina tem uma direção 5'-3 'oposta às outras séries de bases guanina, o quádruplo é dito ter adotado uma topologia antiparalela. Os laços que unem corridas de bases guanina em quadruplexes antiparalelos intramoleculares são diagonais, unindo duas corridas diagonalmente opostas de bases guanina, ou laços do tipo lateral (de borda), unindo duas corridas adjacentes de pares de bases guaninas.

Em quadruplexes formados a partir de DNA de fita dupla, possíveis topologias entre cadeias também foram discutidas. Os quadruplexes entre cadeias contêm guaninas que se originam de ambas as cadeias de dsDNA.

Estrutura e papel funcional no genoma

Após o sequenciamento do genoma humano , muitas sequências ricas em guanina que tinham o potencial de formar quadruplexes foram descobertas. Dependendo do tipo de célula e do ciclo celular, os fatores mediadores, como as proteínas de ligação ao DNA na cromatina , compostas de DNA firmemente enrolado em torno das proteínas histonas , e outras condições ambientais e estresses afetam a formação dinâmica de quadruplexes. Por exemplo, avaliações quantitativas da termodinâmica do crowding molecular indicam que o antiparalelo g-quadruplex é estabilizado pelo crowding molecular. Este efeito parece ser mediado pela alteração da hidratação do DNA e seu efeito na ligação do par de bases de Hoogsteen . Esses quadruplexes pareciam ocorrer prontamente nas extremidades do cromossomo . Além disso, a propensão de formação de g-quádruplo durante a transcrição em sequências de RNA com o potencial para formar estruturas mutuamente exclusivas em grampo ou G-quádruplo depende fortemente da posição da sequência formadora de grampo de cabelo.

Como as enzimas de reparo reconheceriam naturalmente as extremidades dos cromossomos lineares como DNA danificado e os processariam como tal para causar um efeito prejudicial à célula, uma sinalização clara e uma regulação rígida são necessárias nas extremidades dos cromossomos lineares. Os telômeros funcionam para fornecer essa sinalização. Os telômeros, ricos em guanina e com propensão para formar g-quadruplexes, estão localizados nas extremidades terminais dos cromossomos e ajudam a manter a integridade do genoma protegendo essas extremidades terminais vulneráveis ​​da instabilidade.

Essas regiões teloméricas são caracterizadas por longas regiões de repetições CCCTAA: TTAGGG de fita dupla. As repetições terminam com uma protusão 3 'entre 10 e 50 repetições TTAGGG de fita simples. O complexo heterodimérico da enzima ribonucleoproteína telomerase adiciona repetições TTAGGG na extremidade 3 'das fitas de DNA. Nessas saliências de extremidade 3 ', a saliência rica em G pode formar estruturas secundárias, como quadruplexes G se a saliência for maior do que quatro repetições TTAGGG. A presença dessas estruturas impede o alongamento dos telômeros pelo complexo da telomerase.

Quádruplexes teloméricos

Foi demonstrado que as repetições teloméricas em uma variedade de organismos formam essas estruturas quádruplas in vitro e, subsequentemente, também mostraram se formar in vivo . A repetição telomérica humana (que é a mesma para todos os vertebrados ) consiste em muitas repetições do sequenciado (GGTTAG), e os quadruplexes formados por esta estrutura podem estar em estruturas semelhantes a esferas de 5 nm a 8 nm de tamanho e têm estado bem estudado por NMR , TEM e determinação da estrutura de cristal de raios-X . Foi demonstrado que a formação desses quadruplexes em telômeros diminui a atividade da enzima telomerase , que é responsável pela manutenção do comprimento dos telômeros e está envolvida em cerca de 85% de todos os cânceres . Este é um alvo ativo da descoberta de medicamentos, incluindo a telomestatina .

Quádruplexes não teloméricos

Os quádruplos estão presentes em locais diferentes do telômero . A análise dos genomas de humanos, chimpanzés, camundongos e ratos mostrou um número enorme de sequências formadoras de G-quadruplex (pG4) em regiões não teloméricas. Um grande número de G-quadruplexes não teloméricos foram encontrados dentro de promotores de genes e foram conservados em todas as espécies. Da mesma forma, um grande número de G-quadruplexes foi encontrado em E. coli e centenas de outros genomas microbianos. Aqui também, como os vertebrados G-quadruplexes foram enriquecidos em promotores de genes. Além disso, foram encontrados mais de um bilhão de anos conservados do locus G quadruplex em plantas e algas, no gene que codifica a subunidade grande da RNA polimerase II. Embora esses estudos previssem a regulação gênica mediada por G-quadruplex, é improvável que todos os pG4s se formassem in vivo. O proto-oncogene c-myc forma um quadruplex em uma região hipersensível à nuclease crítica para a atividade do gene. Outros genes que mostraram formar quadruplexes G em suas regiões promotoras incluem o gene β-globina de galinha , ubiquitina- ligase RFP2 humana e os proto-oncogenes c-kit , bcl-2 , VEGF , H-ras e N-ras .

Pesquisas de todo o genoma com base em uma regra de dobramento quádruplo foram realizadas, que identificaram 376.000 sequências quadruplex putativas (PQS) no genoma humano , embora nem todas provavelmente se formem in vivo . Estudos semelhantes identificaram G-quadruplexes putativos em procariotos , nomeadamente a bactéria E. coli . Existem vários modelos possíveis de como os quádruplos podem influenciar a atividade do gene, seja por regulação positiva ou regulação negativa . Um modelo é mostrado abaixo, com a formação de G-quadruplex em ou próximo a um promotor bloqueando a transcrição do gene e, portanto, desativando-o. Em outro modelo, o quádruplo formado na fita de DNA não codificante ajuda a manter uma conformação aberta da fita de DNA codificante e aumenta a expressão do respectivo gene.

Função

Foi sugerido que a formação de quádruplos desempenha um papel na troca da cadeia pesada de imunoglobulina . À medida que as células evoluíram, mecanismos para resolver (isto é, desenrolar) quadruplexes que se formam. A formação quádrupla pode ser potencialmente prejudicial para uma célula; as helicases WRN e a proteína da síndrome de Bloom têm uma alta afinidade para resolver quadruplexes G de DNA. A DEAH / RHA helicase, DHX36 , também foi identificada como uma resolvase G quádrupla chave. Em 2009, descobriu-se que uma proteína supressora de metástase NM23H2 (também conhecida como NME2) interage diretamente com o G-quadruplex no promotor do gene c-myc e regula transcricionalmente o c-myc. Mais recentemente, foi relatado que NM23H2 interage com G-quadruplex no promotor do gene da telomerase humana (hTERT) e regula a expressão de hTERT. Em 2019, o telômero-binding-factor-2 (TRF2 ou TERF2) mostrou se ligar a milhares de G-quadruplexes não teloméricos no genoma humano por TRF2 ChIP-seq. Existem muitos estudos que envolvem os quadruplexes na regulação da transcrição positiva e negativa, incluindo a regulação epigenética de genes como o hTERT. A função dos quadruplexes G também foi relatada em permitir a recombinação programada de genes pesados ​​de imunologlobina e o sistema de variação antigênica de pilina da Neisseria patogênica . As funções da estrutura quádrupla no controle da tradução não são tão bem exploradas. A visualização direta das estruturas do quadruplex G em células humanas, bem como a estrutura do cocristal de uma helicase de RNA ligada a um quadruplex G forneceram confirmações importantes de sua relevância para a biologia celular. Os potenciais papéis positivos e negativos dos quadruplexes na replicação e função dos telômeros permanecem controversos. Os laços T e os quadruplexes G são descritos como as duas estruturas terciárias do DNA que protegem as extremidades dos telômeros e regulam o comprimento dos telômeros.

Regulação do genoma através da formação de estruturas G-quadruplex

Muitos dos processos regulatórios do genoma têm sido associados à formação de estruturas G-quadruplex, atribuíveis ao enorme papel que desempenham no reparo do DNA de sítios apurínicos / apirimidínicos também conhecidos como sítios AP. . Uma nova técnica para mapear locais AP foi desenvolvida, conhecida como AP-seq, que utiliza uma sonda reativa a aldeído marcada com biotina (ARP) para marcar certas regiões do genoma onde a ocorrência de danos ao local AP foi significativa. Outro método de sequenciamento de mapeamento de todo o genoma, conhecido como sequenciamento ChIP , foi utilizado para mapear ambos; dano em sítios AP, e a enzima responsável por seu reparo, AP endonuclease 1 (APE1). Ambos os métodos de sequenciamento de mapeamento de todo o genoma, sequenciamento ChIP e ARP, indicaram que a ocorrência de dano no local AP é não aleatória. O dano ao local AP também foi mais prevalente em certas regiões do genoma que contêm promotor ativo específico e marcadores potenciadores, alguns dos quais estavam ligados a regiões responsáveis ​​por adenocarcinoma de pulmão e câncer de cólon. Descobriu-se que o dano no sítio AP é predominante nas regiões PQS do genoma, onde a formação de estruturas G-quadruplex é regulada e promovida pelo processo de reparo de DNA, reparo por excisão de base (BER). Foi comprovado que os processos de reparo por excisão de bases nas células diminuem com o envelhecimento, à medida que seus componentes na mitocôndria começam a diminuir, o que pode levar à formação de muitas doenças, como a doença de Alzheimer (DA). Diz-se que essas estruturas G-quadruplex são formadas nas regiões promotoras do DNA por meio da superelicidade, o que favorece o desenrolamento da estrutura em dupla hélice do DNA e, por sua vez, enlaça as fitas para formar estruturas G-quadruplex em regiões ricas em guanina. A via do BER é sinalizada quando indica um dano oxidativo à base do DNA, onde estruturas como 8-Oxoguanina-DNA glicosilase 1 (OGG1), APE1 e G-quadruplex desempenham um papel importante no seu reparo. Essas enzimas participam da BER para reparar certas lesões de DNA, como a 7,8-diidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que se forma sob estresse oxidativo em bases guanina.

Papel do dano à base de DNA de oxidação endógena na formação de G4

As bases de guanina (G) em G-quadruplex têm o menor potencial redox, fazendo com que sejam mais suscetíveis à formação de 8-oxoguanina (8-oxoG), uma base de DNA oxidada endógena danificada no genoma. Devido a guanina tendo um potencial de redução de electrões mais baixa do que as outras bases de nucleótidos, 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) , é um produto principal conhecido de oxidação do DNA. Sua concentração é usada como uma medida do estresse oxidativo dentro de uma célula. Quando o DNA sofre dano oxidativo, uma possível mudança estrutural na guanina, após radiação ionizante, dá origem a uma forma enol, 8-OH-Gua. Este produto oxidativo é formado por um deslocamento tautomérico do dano original da guanina, 8-oxo-Gua, e representa o dano ao DNA que causa mudanças na estrutura. Esta forma permite que a enzima OGG1 de reparo por excisão de base (BER) se ligue e remova o dano oxidativo com a ajuda de APE1, resultando em um sítio AP. Além disso, um sítio AP é um local no DNA que não tem nem uma base purina ou pirimidina devido a danos no DNA; eles são o tipo de dano endógeno mais comum nas células. Os sítios AP podem ser gerados espontaneamente ou após a clivagem de bases modificadas, como 8-OH-Gua. A geração de um sítio AP permite a fusão do DNA duplex para desmascarar o PQS, adotando uma dobra G-quadruplex. Com o uso de análises de sequenciamento de ChIP de todo o genoma , ensaios baseados em células e análises bioquímicas in vitro, uma conexão foi feita entre sítios AP derivados de base de DNA oxidado e a formação do G-quadruplex.

Contribuição da oxidação do DNA para as doenças

Além disso, a concentração de 8-oxo-dG é um biomarcador conhecido de estresse oxidativo dentro de uma célula, e uma quantidade excessiva de estresse oxidativo tem sido associada à carcinogênese e outras doenças. Quando produzido, o 8-oxo-dG, tem a capacidade de inativar OGG1, evitando assim o reparo do dano ao DNA causado pela oxidação da guanina. A possível inativação permite que danos não reparados ao DNA se acumulem em células não replicantes, como o músculo, e também pode causar envelhecimento. Além disso, o dano oxidativo ao DNA, como o 8-oxo-dG, contribui para a carcinogênese por meio da modulação da expressão gênica ou da indução de mutações. Na condição de que o 8-oxo-dG seja reparado por BER, partes da proteína de reparo são deixadas para trás, o que pode levar a alterações epigenéticas ou à modulação da expressão gênica. Após a inserção de 8-oxo-dG no gene da timidina quinase de humanos, foi determinado que se 8-oxo-dG não fosse verificado e não fosse reparado por BER, ele poderia levar a mutações frequentes e, eventualmente, carcinogênese.

Papel do APE1 na regulação do gene

A endonuclease 1 AP (APE1) é uma enzima responsável pela promoção e formação de estruturas G quadruplex. APE1 é principalmente responsável por reparar os danos causados ​​aos sites AP através da via BER. APE1 é considerado muito crucial, pois o dano ao local AP é conhecido por ser o tipo mais recorrente de dano endógeno ao DNA. A oxidação de certas bases purinas, como a guanina, forma nucleotídeos oxidados que prejudicam a função do DNA por nucleotídeos incompatíveis nas sequências. Isso é mais comum em sequências PQS que formam estruturas oxidadas, como a 8-oxoguanina . Uma vez que a célula está ciente do estresse oxidativo e dos danos, ela recruta OGG1 para o local, cuja principal função é iniciar a via de BER. OGG1 faz isso clivando a base oxidada e, assim, criando um sítio AP, principalmente por meio do processo de superelicidade negativa. Este sítio AP então sinaliza às células para se envolverem na ligação de APE1, que se liga à região duplex aberta. A ligação de APE1 então desempenha um papel importante ao estabilizar a formação de estruturas G-quadruplex nessa região. Isso promove a formação de estruturas G-quadruplex pelo dobramento do suporte. Este processo de looping traz quatro bases em estreita proximidade que serão mantidas juntas pelo emparelhamento de bases Hoogsteen. Após esse estágio, o APE1 é acetilado por vários resíduos de lisina na cromatina, formando o APE1 acetilado (AcAPE1). AcAPE1 é muito importante para a via de BER, pois atua como um coativador transcricional ou corepressor, funcionando para carregar fatores de transcrição (FT) no local do dano, permitindo-lhe regular a expressão gênica. AcAPE1 também é muito importante, pois permite que o APE1 se ligue por longos períodos de tempo por retardo de sua dissociação da sequência, permitindo que o processo de reparo seja mais eficiente. A desacetilação de AcAPE1 é a força motriz por trás do carregamento desses TFs, onde APE1 se dissocia das estruturas G quadruplex. Quando um estudo infrarregulou a presença de APE1 e AcAPE1 na célula, a formação de estruturas G-quadruplex foi inibida, o que comprova a importância do APE1 para a formação dessas estruturas. No entanto, nem todas as estruturas do quadruplex G requerem APE1 para a formação; na verdade, algumas delas formaram estruturas do quadruplex G maiores na sua ausência. Portanto, podemos concluir que APE1 tem dois papéis importantes na regulação do genoma - Estabilizar a formação de estruturas g-quadruplex e carregar os fatores de transcrição no sítio AP

Câncer

Telômeros

As sequências formadoras de G-quadruplex são prevalentes em células eucarióticas, especialmente em telômeros, fitas 5 'não traduzidas e pontos quentes de translocação. Os quadruplexes G podem inibir a função celular normal e, em células saudáveis, são fácil e prontamente desfeitos pela helicase . No entanto, em células cancerosas que sofreram mutação da helicase, esses complexos não podem ser desfeitos e podem causar danos à célula. Isso causa a replicação de células danificadas e cancerosas. Para avanços terapêuticos, a estabilização dos quadruplexes G das células cancerosas pode inibir o crescimento e a replicação das células, levando à morte da célula .

Regiões Promotoras

Junto com a associação de G-quadruplexes em regiões teloméricas do DNA, estruturas G-quadruplex foram identificadas em várias regiões promotoras de proto- oncogene humano . As estruturas mais presentes nas regiões promotoras desses oncogenes tendem a ser estruturas de DNA quadruplex G de fita paralela. Alguns desses oncogenes incluem c-KIT, PDGF-A, c-Myc e VEGF, mostrando a importância dessa estrutura secundária no crescimento e desenvolvimento do câncer. Embora a formação da estrutura do quadruplex G varie até certo ponto para as diferentes regiões promotoras dos oncogenes, a estabilização consistente dessas estruturas foi encontrada no desenvolvimento do câncer. A pesquisa terapêutica atual concentra-se ativamente em direcionar esta estabilização de estruturas G-quadruplex para interromper o crescimento e divisão celular desregulados.

Uma região de gene particular, a via c-myc, desempenha um papel integral na regulação de um produto de proteína, c-Myc. Com este produto, a proteína c-Myc atua nos processos de apoptose e crescimento ou desenvolvimento celular e como um controle transcricional na transcriptase reversa da telomerase humana . A interação do promotor c-Myc G-quadruplex com NM23H2 foi mostrado para regular c-Myc em células cancerosas em 2009

A regulação de c-myc através da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) também é regulada diretamente através do promotor G-quadruplex pela interação com o fator de transcrição NM23H2 onde as modificações epigenéticas eram dependentes da associação NM23H2-G-quadruplex. Recentemente, a regulação epigenética do hTERT relatou ser mediada pela interação do promotor G-quadruplex do hTERT com o fator telomérico TRF2.

Outra via gênica lida com o gene VEGF, Fator de Crescimento Endotelial Vascular, que permanece envolvido no processo de angiogênese ou na formação de novos vasos sanguíneos. A formação de uma estrutura G-quadruplex intramolecular foi demonstrada por meio de estudos no trato polipurina da região promotora do gene VEGF. Por meio de pesquisas recentes sobre o papel da função do quadruplex G in vivo, a estabilização das estruturas do quadruplex G demonstrou regular a transcrição do gene VEGF, com inibição dos fatores de transcrição nessa via. As estruturas G-quadruplex intramoleculares são formadas principalmente através da sequência abundante de guanina na região promotora desta via específica. O gene do inibidor da quinase-1 CDKN1A do ponto de verificação do ciclo celular dependente da ciclina (também conhecido como p21) abriga o promotor G-quadruplex. A interação deste G-quadruplex com TRF2 (também conhecido como TERF2) resultou na regulação epigenética de p21, que foi testada usando o ligante de ligação de G-quadruplex 360A.

O fator induzível por hipóxia 1ɑ, HIF-1ɑ, permanece envolvido na sinalização do câncer por meio de sua ligação ao Elemento de Resposta à Hipóxia, HRE, na presença de hipóxia para iniciar o processo de angiogênese . Por meio de pesquisas recentes sobre essa via gênica específica, a região da polipurina e da polipirimidina permite a transcrição desse gene específico e a formação de uma estrutura G-quadruplex intramolecular. No entanto, mais pesquisas são necessárias para determinar se a formação do G-quadruplex regula a expressão desse gene de forma positiva ou negativa.

O oncogene c-kit lida com uma via que codifica um RTK, que demonstrou ter níveis de expressão elevados em certos tipos de câncer. A rica sequência de guanina desta região promotora mostrou a capacidade de formar uma variedade de quadruplexes. A pesquisa atual nesta via está se concentrando na descoberta da função biológica desta formação quadruplex específica na via c-kit, enquanto esta sequência quádrupla foi observada em várias espécies.

O oncogene RET atua na transcrição da quinase, que tem sido abundante em certos tipos de câncer. A sequência rica em guanina na região do promotor para esta via exala uma necessidade para a transcrição de linha de base deste receptor tirosina quinase. Em certos tipos de câncer, a proteína RET mostrou níveis de expressão aumentados. A pesquisa nesta via sugeriu a formação de um G-quadruplex na região promotora e um alvo aplicável para tratamentos terapêuticos.

Outra via de oncogene envolvendo PDGF-A, fator de crescimento derivado de plaquetas, envolve o processo de cicatrização de feridas e funciona como fatores de crescimento mitogênicos para as células. Altos níveis de expressão de PDGF foram associados ao aumento do crescimento celular e câncer. A presença de uma sequência rica em guanina na região do promotor de PDGF-A exibiu a capacidade de formar estruturas quadruplex G paralelas intramoleculares e continua sugerido que desempenhe um papel na regulação da transcrição de PDGF-A. No entanto, a pesquisa também identificou a presença de estruturas G-quadruplex dentro desta região devido à interação de TMPyP4 com esta sequência promotora.

Terapêutica

Os telômeros são geralmente compostos de G-quadruplexes e permanecem alvos importantes para pesquisas e descobertas terapêuticas. Esses complexos têm uma alta afinidade para os anéis de porfirina, o que os torna agentes anticâncer eficazes. No entanto, o uso de TMPyP4 foi limitado devido à sua não seletividade para telômeros de células cancerosas e DNA de fita dupla normal (dsDNA). Para resolver esse problema, o análogo de TMPyP4, foi sintetizado conhecido como 5Me, que tem como alvo apenas o DNA G quadruplex, que inibe o crescimento do câncer de forma mais eficaz do que TMPyP4.

O projeto e o desenvolvimento de ligantes continuam sendo um importante campo de pesquisa em reagentes terapêuticos devido à abundância de quadruplexes G e suas múltiplas diferenças conformacionais. Um tipo de ligante envolvendo um derivado de quindolina, SYUIQ-05, utiliza a estabilização de G-quadruplexes em regiões promotoras para inibir a produção do produto da proteína c-Myc e da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT). Esta via principal de direcionamento a esta região resulta na falta de alongamento da telomerase, levando ao desenvolvimento celular interrompido. Mais pesquisas permanecem necessárias para a descoberta de um único gene alvo para minimizar a reatividade indesejada com atividade antitumoral mais eficiente.

Ligantes que ligam quadruplexes

Uma maneira de induzir ou estabilizar a formação do quadruplex G é introduzir uma molécula que pode se ligar à estrutura do quadruplex G. Vários ligantes , que podem ser pequenas moléculas e proteínas , podem se ligar ao G quadruplex. Estes ligandos podem ocorrer naturalmente ou ser sintéticos. Este tem se tornado um campo cada vez mais amplo de pesquisa em genética, bioquímica e farmacologia.

Foi demonstrado que as porfirinas catiônicas se ligam intercaladamente com G-quadruplexes, bem como com a molécula telomestatina .

A ligação de ligantes a G-quadruplexes é vital para atividades anticâncer porque G-quadruplexes são encontrados tipicamente em pontos quentes de translocação. MM41, um ligante que se liga seletivamente para um quadruplex no promotor BCL-2 , é moldado com um núcleo central e 4 cadeias laterais se ramificando estericamente. A forma do ligante é vital porque é muito parecida com o quadruplex que tem quartetos empilhados e as alças de ácidos nucléicos que os mantêm unidos. Quando ligado, o cromóforo central de MM41 está situado no topo do quarteto G do terminal 3 'e as cadeias laterais do ligante se associam às alças do quádruplo. O quarteto e o cromóforo estão ligados por uma ligação π-π, enquanto as cadeias laterais e loops não estão ligados, mas estão em estreita proximidade. O que torna essa ligação forte é a fluidez na posição das alças para melhor se associarem às cadeias laterais do ligante.

TMPyP4, uma porfirina catiônica, é um ligante de ligação de G4 mais conhecido que ajuda a reprimir c-Myc.  A forma como o TMPyP4 se liga ao G4 é semelhante ao MM41, com o anel se acumulando no quarteto G externo e as cadeias laterais se associando aos loops do G4.

Ao projetar ligantes para serem ligados a G-quadruplexes, os ligantes têm uma maior afinidade para G-quadruplexes dobrados paralelamente. Verificou-se que ligantes com cadeias laterais menores se ligam melhor ao quádruplo porque ligantes menores têm densidade de elétrons mais concentrada . Além disso, as ligações de hidrogênio de ligantes com cadeias laterais menores são mais curtas e, portanto, mais fortes. Ligantes com cadeias laterais móveis, aqueles que são capazes de girar em torno de seu cromóforo central, associam-se mais fortemente aos quadruplexes G porque a conformação das alças G4 e as cadeias laterais do ligante podem se alinhar.

Técnicas de previsão quádrupla

Identificar e prever sequências que têm a capacidade de formar quadruplexes é uma ferramenta importante para compreender melhor o seu papel. Geralmente, uma correspondência de padrão simples é usada para pesquisar possíveis sequências de formação quádrupla intrastrand: d (G 3+ N 1-7 G 3+ N 1-7 G 3+ N 1-7 G 3+ ), onde N é qualquer nucleotídeo base (incluindo guanina ). Esta regra tem sido amplamente utilizada em algoritmos on-line . Embora a regra identifique efetivamente locais de formação de G-quadruplex, ela também identifica um subconjunto de repetições de espelho de homopurina imperfeitas capazes de formação de triplex e formação de motivo i de fita C. Além disso, essas sequências também têm a capacidade de formar estruturas com deslizamento e retrocesso que são intermediários implícitos na formação de estruturas de DNA quádruplas e triplas. Em um estudo, foi descoberto que o número observado por par de bases (ou seja, a frequência) desses motivos aumentou rapidamente no eumetazoa para o qual sequências genômicas completas estão disponíveis. Isso sugere que as sequências podem estar sob seleção positiva possibilitada pela evolução de sistemas capazes de suprimir a formação de estruturas não-B.

Métodos para estudar G quadruplexes

Uma série de métodos experimentais foram desenvolvidos para apoiar a previsão computacional de G quadruplexes. Esses métodos podem ser amplamente definidos em duas classes: métodos biofísicos e bioquímicos.

Métodos bioquímicos

Técnicas bioquímicas foram empregadas para interrogar a formação do quadruplex G em um contexto de sequência mais longo. No ensaio de parada da DNA polimerase, a formação de um G-quadruplex em um molde de DNA pode atuar como um obstáculo e causar a paralisação da polimerase, que interrompe a extensão do primer. O sulfato de dimetil (DMS) seguido pelo ensaio de clivagem da piperidina é baseado no fato de que a formação de um G-quadruplex proibirá a metilação da N7 guanina causada pelo DMS, levando a um padrão de proteção observado na região do DNA G-quadruplex após a piperidina decote.

Métodos biofísicos

A topologia da estrutura quadruplex G pode ser determinada monitorando os sinais de dicroísmo circular positivo ou negativo (CD) em comprimentos de onda específicos. G-quadruplexes paralelos têm sinais CD negativos e positivos em 240 e 262 nm, respectivamente, enquanto G-quadruplexes antiparalelos colocam esses sinais em 262 e 295 nm, respectivamente. Para verificar a formação do G-quadruplex, deve-se também realizar os experimentos de CD sob estabilização não-G-quadruplex (Li +) e condições de estabilização G-quadruplex (como K + ou com ligantes G-quadruplex), e varrer em direção à região ultravioleta (180–230 nm). Da mesma forma, a termoestabilidade da estrutura G-quadruplex pode ser identificada observando o sinal UV em 295 nm. Após a fusão do G quádruplo, a absorbância de UV em 295 nm diminui, levando a um deslocamento hipocrômico que é uma característica distintiva da estrutura do G quádruplo. Outra abordagem para detecção de G-quadruplexes inclui métodos baseados em nanoporos . Em primeiro lugar, foi mostrado que os nanoporos biológicos podem detectar G-quadruplexes com base na exclusão de tamanho e interação específica de G-quadruplex e nanocavidade de proteína. A nova abordagem combina nanoporos de estado sólido e nanotecnologia de DNA para a detecção livre de marcadores de G-quadruplexes, para seu mapeamento em dsDNA e para monitorar a formação de G-quadruplex.

Papel nas doenças neurológicas

Os quadruplexes G têm sido implicados em distúrbios neurológicos por meio de dois mecanismos principais. A primeira é por meio de expansões de repetições G dentro de genes que levam à formação de estruturas G-quadruplex que causam diretamente a doença, como é o caso do gene C9orf72 e da esclerose lateral amiotrófica (ALS) ou demência frontotemporal (FTD). O segundo mecanismo é através de mutações que afetam a expressão das proteínas de ligação do G-quadruplex, como visto no gene 1 do retardo mental do X frágil (FMR1) e na Síndrome do X Frágil .

O gene C9orf72 codifica a proteína C9orf72, que é encontrada em todo o cérebro no citoplasma neuronal e nos terminais pré - sinápticos . Mutações no gene C9orf72 têm sido associadas ao desenvolvimento de FTD e ALS. Essas duas doenças têm uma relação causal com as repetições GGGGCC (G 4 C 2 ) dentro do primeiro íntron do gene C9orf72. Indivíduos normais tipicamente têm cerca de 2 a 8 repetições G 4 C 2 , mas indivíduos com FTD ou ALS têm de 500 a vários milhares de repetições G 4 C 2 . Foi demonstrado que o RNA transcrito dessas repetições forma G quadruplexes estáveis, com evidências mostrando que as repetições G 4 C 2 no DNA têm a capacidade de formar estruturas G quadruplex paralelas e antiparalelas mistas também. Demonstrou-se que esses transcritos de RNA contendo repetições G 4 C 2 se ligam e separam uma ampla variedade de proteínas, incluindo a nucleolina . A nucleolina está envolvida na síntese e maturação de ribossomos dentro do núcleo, e a separação da nucleolina pelos transcritos de RNA mutados prejudica a função nucleolar e a síntese de RNA ribossômico.

A proteína de retardo mental X frágil (FMRP) é uma proteína amplamente expressa codificada pelo gene FMR1 que se liga a estruturas secundárias do quadruplex G em neurônios e está envolvida na plasticidade sináptica . FMRP atua como um regulador negativo da tradução, e sua ligação estabiliza estruturas G-quadruplex em transcritos de mRNA, inibindo o alongamento do ribossomo do mRNA no dendrito do neurônio e controlando o tempo de expressão do transcrito. Mutações neste gene podem causar o desenvolvimento da Síndrome do X Frágil, autismo e outros distúrbios neurológicos. Especificamente, a Síndrome do X Frágil é causada por um aumento de 50 a mais de 200 repetições CGG no exon 13 do gene FMR1. Essa expansão repetida promove a metilação do DNA e outras modificações epigenéticas de heterocromatina de FMR1 que impedem a transcrição do gene, levando a baixos níveis patológicos de FMRP.

Abordagens terapêuticas

Intervenções mediadas por antisense e ligantes de pequenas moléculas são estratégias comuns usadas para direcionar doenças neurológicas ligadas a repetições de expansão G-quadruplex. Portanto, essas técnicas são especialmente vantajosas para o direcionamento de doenças neurológicas que possuem um mecanismo de ganho de função, que é quando o produto do gene alterado tem uma nova função ou nova expressão de um gene; isso foi detectado no C9orf72 (quadro de leitura aberto do cromossomo 9 72).

A terapia antisense é o processo pelo qual fitas sintetizadas de ácidos nucléicos são usadas para se ligar direta e especificamente ao mRNA produzido por um determinado gene, que o inativará. Os oligonucleotídeos anti-sentido (ASOs) são comumente usados ​​para direcionar o RNA C9orf72 da região de repetição de expansão GGGGCC G-quadruplex, o que reduziu a toxicidade em modelos celulares de C9orf72. ASOs foram usados ​​anteriormente para restaurar fenótipos normais em outras doenças neurológicas que têm mecanismos de ganho de função, a única diferença é que foi usado na ausência de regiões de repetição de expansão G-quadruplex.

Outra técnica comumente usada é a utilização de ligantes de pequenas moléculas . Eles podem ser usados ​​para direcionar as regiões do quadruplex G que causam distúrbios neurológicos. Existem aproximadamente 1.000 vários ligantes G-quadruplex nos quais eles são capazes de interagir por meio de seus anéis aromáticos ; isso permite que os ligantes de moléculas pequenas se acumulem nas tétrades terminais planas dentro das regiões G quadruplex. Uma desvantagem de usar ligantes de moléculas pequenas como técnica terapêutica é que a especificidade é difícil de gerenciar devido à variabilidade dos quadruplexes G em suas sequências primárias, orientação, estabilidade termodinâmica e estequiometria de fita de ácido nucleico. Até agora, nenhum ligante de molécula pequena foi capaz de ser perfeitamente específico para uma única sequência G quadruplex. No entanto, uma porfirina catiônica conhecida como TMPyP4 é capaz de se ligar à região de repetição C9orf72 GGGGCC, o que faz com que a região de repetição G-quadruplex se desdobre e perca suas interações com proteínas, fazendo com que ela perca sua funcionalidade. Ligantes de moléculas pequenas, compostos principalmente de chumbo, também podem ter como alvo as regiões de repetição GGGGCC e, em última análise, reduziram a tradução não ATG associada à repetição e os focos de RNA em células neuronais derivadas de pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA). Isso fornece evidências de que ligantes de moléculas pequenas são um processo eficaz e eficiente para direcionar regiões GGGGCC, e que a especificidade para a ligação de ligantes de moléculas pequenas é um objetivo viável para a comunidade científica.

Os complexos de metal têm uma série de características que os tornam particularmente adequados como ligantes de DNA G4 e, portanto, como drogas em potencial. Embora o metal desempenhe um papel amplamente estrutural na maioria dos ligantes G4, também há exemplos em que ele interage diretamente com G4s por meio de interações eletrostáticas ou coordenação direta com nucleobases.

Referências

Leitura adicional

links externos

Sites quadruplex

Ferramentas para prever motivos G-quadruplex