História da biologia molecular - History of molecular biology

A história da biologia molecular começa na década de 1930 com a convergência de várias disciplinas biológicas e físicas anteriormente distintas: bioquímica , genética , microbiologia , virologia e física . Com a esperança de compreender a vida em seu nível mais fundamental, vários físicos e químicos também se interessaram pelo que se tornaria a biologia molecular .

Em seu sentido moderno, a biologia molecular tenta explicar os fenômenos da vida a partir das propriedades macromoleculares que os geram. Duas categorias de macromoléculas em particular são o foco do biólogo molecular: 1) ácidos nucléicos , entre os quais o mais famoso é o ácido desoxirribonucléico (ou DNA), o constituinte dos genes , e 2) proteínas , que são os agentes ativos dos organismos vivos . Uma definição do escopo da biologia molecular, portanto, é caracterizar a estrutura, função e relações entre esses dois tipos de macromoléculas. Esta definição relativamente limitada será suficiente para nos permitir estabelecer uma data para a chamada "revolução molecular", ou pelo menos estabelecer uma cronologia de seus desenvolvimentos mais fundamentais.

Visao geral

Em suas primeiras manifestações, a biologia molecular - o nome foi cunhado por Warren Weaver, da Fundação Rockefeller em 1938 - era uma ideia de explicações físicas e químicas da vida, em vez de uma disciplina coerente. Após o advento da teoria cromossômica mendeliana da hereditariedade na década de 1910 e o amadurecimento da teoria atômica e da mecânica quântica na década de 1920, tais explicações pareciam ao nosso alcance. Weaver e outros encorajaram (e financiaram) pesquisas na interseção da biologia, química e física, enquanto físicos proeminentes como Niels Bohr e Erwin Schrödinger voltaram sua atenção para a especulação biológica. No entanto, nas décadas de 1930 e 1940, não estava de forma alguma claro qual - se alguma - a pesquisa interdisciplinar daria frutos; trabalhos em química de colóides , biofísica e biologia de radiação , cristalografia e outros campos emergentes pareciam todos promissores.

Em 1940, George Beadle e Edward Tatum demonstraram a existência de uma relação precisa entre genes e proteínas. No decorrer de seus experimentos conectando a genética à bioquímica, eles trocaram a Drosophila, o esteio da genética, por um organismo modelo mais apropriado , o fungo Neurospora ; a construção e a exploração de novos organismos-modelo se tornariam um tema recorrente no desenvolvimento da biologia molecular. Em 1944, Oswald Avery , trabalhando no Instituto Rockefeller de Nova York , demonstrou que os genes são feitos de DNA (veja o experimento Avery-MacLeod-McCarty ). Em 1952, Alfred Hershey e Martha Chase confirmaram que o material genético do bacteriófago , o vírus que infecta as bactérias, é feito de DNA (veja o experimento Hershey-Chase ). Em 1953, James Watson e Francis Crick descobriram a estrutura em dupla hélice da molécula de DNA com base nas descobertas feitas por Rosalind Franklin . Em 1961, François Jacob e Jacques Monod demonstraram que os produtos de certos genes regulavam a expressão de outros genes agindo em locais específicos na borda desses genes. Eles também levantaram a hipótese da existência de um intermediário entre o DNA e seus produtos protéicos, que eles chamaram de RNA mensageiro . Entre 1961 e 1965, foi determinada a relação entre as informações contidas no DNA e a estrutura das proteínas: existe um código, o código genético , que cria uma correspondência entre a sucessão de nucleotídeos na sequência de DNA e uma série de aminoácidos em proteínas.

As principais descobertas da biologia molecular ocorreram em um período de apenas cerca de 25 anos. Mais quinze anos foram necessários para que novas e mais sofisticadas tecnologias, hoje reunidas sob o nome de engenharia genética , permitissem o isolamento e a caracterização de genes, em particular de organismos altamente complexos.

A exploração do domínio molecular

Se avaliarmos a revolução molecular no contexto da história biológica, é fácil notar que é o culminar de um longo processo que começou com as primeiras observações ao microscópio. O objetivo desses primeiros pesquisadores era compreender o funcionamento dos organismos vivos, descrevendo sua organização no nível microscópico. A partir do final do século 18, a caracterização das moléculas químicas que compõem os seres vivos ganhou cada vez mais atenção, juntamente com o nascimento da química fisiológica no século 19, desenvolvida pelo químico alemão Justus von Liebig e a partir do nascimento da bioquímica no início do século 20, graças a outro químico alemão Eduard Buchner . Entre as moléculas estudadas pelos químicos e as minúsculas estruturas visíveis ao microscópio óptico, como o núcleo celular ou os cromossomos, havia uma zona obscura, "o mundo das dimensões ignoradas", como foi chamado pelo físico-químico Wolfgang Ostwald . Este mundo é povoado por colóides , compostos químicos cuja estrutura e propriedades não eram bem definidas.

Os sucessos da biologia molecular derivaram da exploração daquele mundo desconhecido por meio das novas tecnologias desenvolvidas por químicos e físicos: difração de raios X , microscopia eletrônica , ultracentrifugação e eletroforese . Esses estudos revelaram a estrutura e função das macromoléculas.

Um marco nesse processo foi o trabalho de Linus Pauling em 1949, que pela primeira vez vinculou a mutação genética específica em pacientes com doença falciforme a uma alteração demonstrada em uma proteína individual, a hemoglobina nos eritrócitos de indivíduos heterozigotos ou homozigotos .

O encontro entre bioquímica e genética

O desenvolvimento da biologia molecular é também o encontro de duas disciplinas que avançaram consideravelmente ao longo dos primeiros trinta anos do século XX: a bioquímica e a genética. O primeiro estuda a estrutura e função das moléculas que constituem os seres vivos. Entre 1900 e 1940, foram descritos os processos centrais do metabolismo : o processo de digestão e a absorção dos elementos nutritivos derivados da alimentação, como os açúcares. Cada um desses processos é catalisado por uma enzima específica . As enzimas são proteínas, como os anticorpos presentes no sangue ou as proteínas responsáveis ​​pela contração muscular. Como consequência, o estudo das proteínas, de sua estrutura e síntese, passou a ser um dos principais objetivos dos bioquímicos.

A segunda disciplina da biologia que se desenvolveu no início do século 20 é a genética. Após a redescoberta das leis de Mendel através dos estudos de Hugo de Vries , Carl Correns e Erich von Tschermak em 1900, essa ciência começou a tomar forma graças à adoção por Thomas Hunt Morgan , em 1910, de um organismo modelo para estudos genéticos , a famosa mosca da fruta ( Drosophila melanogaster ). Pouco depois, Morgan mostrou que os genes estão localizados nos cromossomos. Após essa descoberta, ele continuou trabalhando com Drosophila e, junto com vários outros grupos de pesquisa, confirmou a importância do gene na vida e no desenvolvimento dos organismos. No entanto, a natureza química dos genes e seus mecanismos de ação permaneceram um mistério. Os biólogos moleculares se comprometeram com a determinação da estrutura e a descrição das complexas relações entre genes e proteínas.

O desenvolvimento da biologia molecular não foi apenas fruto de algum tipo de "necessidade" intrínseca na história das idéias, mas foi um fenômeno caracteristicamente histórico, com todas as suas incógnitas, imponderáveis ​​e contingências: os notáveis ​​desenvolvimentos da física no início de o século XX evidenciou o relativo atraso no desenvolvimento da biologia, que se tornou a "nova fronteira" na busca de conhecimento sobre o mundo empírico. Além disso, os desenvolvimentos da teoria da informação e da cibernética na década de 1940, em resposta às exigências militares, trouxeram para a nova biologia um número significativo de ideias férteis e, principalmente, metáforas.

A escolha das bactérias e de seu vírus, o bacteriófago, como modelos para o estudo dos mecanismos fundamentais da vida foi quase natural - são os menores organismos vivos que se conhece - e ao mesmo tempo fruto de escolhas individuais. Esse modelo deve seu sucesso, sobretudo, à fama e ao senso de organização de Max Delbrück , físico alemão, que soube criar um grupo de pesquisa dinâmico, sediado nos Estados Unidos, cujo escopo exclusivo era o estudo do bacteriófago. : o grupo de fago .

O panorama geográfico dos desenvolvimentos da nova biologia foi condicionado sobretudo por trabalhos anteriores. Os Estados Unidos, onde a genética se desenvolveu mais rapidamente, e o Reino Unido, onde coexistia a genética e a pesquisa bioquímica de níveis altamente avançados, estavam na vanguarda. A Alemanha, berço das revoluções da física, com as melhores cabeças e os mais avançados laboratórios de genética do mundo, deveria ter um papel primordial no desenvolvimento da biologia molecular. Mas a história decidiu de forma diferente: a chegada dos nazistas em 1933 - e, em um grau menos extremo, o enrijecimento das medidas totalitárias na Itália fascista - causou a emigração de um grande número de cientistas judeus e não judeus. A maioria deles fugiu para os Estados Unidos ou Reino Unido, dando um impulso extra ao dinamismo científico dessas nações. Em última análise, esses movimentos tornaram a biologia molecular uma ciência verdadeiramente internacional desde o início.

História da bioquímica do DNA

O estudo do DNA é uma parte central da biologia molecular.

Primeiro isolamento de DNA

Trabalhando no século 19, os bioquímicos isolaram inicialmente DNA e RNA (misturados) dos núcleos das células. Eles foram relativamente rápidos em avaliar a natureza polimérica de seus isolados de "ácido nucleico", mas só mais tarde perceberam que os nucleotídeos eram de dois tipos - um contendo ribose e o outro desoxirribose . Foi essa descoberta subsequente que levou à identificação e nomeação do DNA como uma substância distinta do RNA.

Friedrich Miescher (1844-1895) descobriu uma substância que chamou de "nucleína" em 1869. Um pouco mais tarde, ele isolou uma amostra pura do material agora conhecido como DNA do esperma do salmão e, em 1889, seu aluno, Richard Altmann , deu-lhe o nome "ácido nucleico". Descobriu-se que esta substância existe apenas nos cromossomos.

Em 1919, Phoebus Levene no Instituto Rockefeller identificou os componentes (as quatro bases, o açúcar e a cadeia de fosfato) e mostrou que os componentes do DNA estavam ligados na ordem fosfato-açúcar-base. Ele chamou cada uma dessas unidades de nucleotídeo e sugeriu que a molécula de DNA consistia em uma cadeia de unidades de nucleotídeos unidas por grupos de fosfato, que são a "espinha dorsal" da molécula. No entanto, Levene achou que a corrente era curta e que as bases se repetiam na mesma ordem fixa. Torbjörn Caspersson e Einar Hammersten mostraram que o DNA era um polímero.

Cromossomos e características herdadas

Em 1927, Nikolai Koltsov propôs que os traços herdados seriam herdados por meio de uma "molécula hereditária gigante" que seria composta de "duas fitas de espelho que se replicariam de uma forma semiconservadora usando cada fita como modelo". Max Delbrück , Nikolay Timofeev-Ressovsky e Karl G. Zimmer publicaram resultados em 1935, sugerindo que os cromossomos são moléculas muito grandes, cuja estrutura pode ser alterada por tratamento com raios-X e que, ao mudar sua estrutura, era possível mudar as características hereditárias governadas por esses cromossomos. Em 1937, William Astbury produziu os primeiros padrões de difração de raios-X do DNA. Ele não foi capaz de propor a estrutura correta, mas os padrões mostraram que o DNA tinha uma estrutura regular e, portanto, seria possível deduzir o que era essa estrutura.

Em 1943, Oswald Theodore Avery e uma equipe de cientistas descobriram que características próprias da forma "lisa" do Pneumococcus poderiam ser transferidas para a forma "áspera" da mesma bactéria simplesmente tornando disponível a forma "lisa" (S) morta para a forma "bruta" (R) ao vivo. De forma bastante inesperada, as bactérias R Pneumococcus vivas foram transformadas em uma nova cepa da forma S, e as características S transferidas revelaram-se hereditárias. Avery chamou o meio de transferência de características de princípio transformador ; ele identificou o DNA como o princípio transformador, e não a proteína como se pensava anteriormente. Ele essencialmente refez a experiência de Frederick Griffith . Em 1953, Alfred Hershey e Martha Chase fizeram um experimento (experimento Hershey-Chase ) que mostrou, no fago T2 , que o DNA é o material genético (Hershey dividiu o prêmio Nobel com Luria).

Descoberta da estrutura do DNA

Na década de 1950, três grupos estabeleceram como objetivo determinar a estrutura do DNA. O primeiro grupo a começar foi no King's College London e foi liderado por Maurice Wilkins e mais tarde se juntou a Rosalind Franklin . Outro grupo formado por Francis Crick e James Watson estava em Cambridge . Um terceiro grupo estava na Caltech e era liderado por Linus Pauling . Crick e Watson construíram modelos físicos usando hastes e bolas de metal, nos quais incorporaram as estruturas químicas conhecidas dos nucleotídeos, bem como a posição conhecida das ligações que unem um nucleotídeo ao outro ao longo do polímero. No King's College, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin examinaram os padrões de difração de raios-X das fibras de DNA. Dos três grupos, apenas o grupo de Londres foi capaz de produzir padrões de difração de boa qualidade e, portanto, produzir dados quantitativos suficientes sobre a estrutura.

Estrutura helicoidal

Em 1948, Pauling descobriu que muitas proteínas incluíam formas helicoidais (ver hélice alfa ). Pauling deduziu essa estrutura de padrões de raios-X e de tentativas de modelar fisicamente as estruturas. (Pauling também sugeriu mais tarde uma estrutura de DNA helicoidal de três cadeias incorreta com base nos dados de Astbury.) Mesmo nos dados iniciais de difração do DNA de Maurice Wilkins, era evidente que a estrutura envolvia hélices. Mas esse insight foi apenas o começo. Restavam as questões de quantos fios se juntavam, se esse número era o mesmo para cada hélice, se as bases apontavam para o eixo helicoidal ou para longe e, em última análise, quais eram os ângulos e coordenadas explícitas de todas as ligações e átomos. Essas questões motivaram os esforços de modelagem de Watson e Crick.

Nucleotídeos complementares

Em sua modelagem, Watson e Crick se restringiram ao que consideraram química e biologicamente razoável. Ainda assim, a amplitude de possibilidades era muito ampla. Um grande avanço ocorreu em 1952, quando Erwin Chargaff visitou Cambridge e inspirou Crick com uma descrição dos experimentos que Chargaff havia publicado em 1947. Chargaff observou que as proporções dos quatro nucleotídeos variam entre uma amostra de DNA e a seguinte, mas para pares específicos de nucleotídeos - adenina e timina, guanina e citosina - os dois nucleotídeos estão sempre presentes em proporções iguais.

O modelo de DNA de Crick e Watson construído em 1953, foi reconstruído em grande parte a partir de suas peças originais em 1973 e doado ao National Science Museum de Londres.

Usando difração de raios-X , bem como outros dados de Rosalind Franklin e suas informações de que as bases estavam emparelhadas, James Watson e Francis Crick chegaram ao primeiro modelo preciso da estrutura molecular do DNA em 1953, que foi aceito por meio de inspeção por Rosalind Franklin. A descoberta foi anunciada em 28 de fevereiro de 1953; o primeiro artigo de Watson / Crick apareceu na Nature em 25 de abril de 1953. Sir Lawrence Bragg , o diretor do Laboratório Cavendish , onde Watson e Crick trabalharam, deu uma palestra no Guy's Hospital Medical School em Londres na quinta-feira, 14 de maio de 1953, que resultou em um artigo de Ritchie Calder no News Chronicle of London, na sexta-feira, 15 de maio de 1953, intitulado "Por que você é você. Segredo mais próximo da vida". A notícia chegou aos leitores do The New York Times no dia seguinte; Victor K. McElheny , ao pesquisar sua biografia, "Watson e DNA: Fazendo uma revolução científica", encontrou um recorte de um artigo de seis parágrafos do New York Times escrito em Londres e datado de 16 de maio de 1953 com o título "Forma de vida Unidade 'na célula é digitalizada. " O artigo saiu em uma edição anterior e foi então puxado para abrir espaço para notícias consideradas mais importantes. ( O New York Times posteriormente publicou um artigo mais longo em 12 de junho de 1953). O jornal de graduação da Universidade de Cambridge também publicou seu próprio pequeno artigo sobre a descoberta no sábado, 30 de maio de 1953. O anúncio original de Bragg na Conferência Solvay sobre proteínas na Bélgica em 8 de abril de 1953 não foi divulgado pela imprensa. Em 1962, Watson, Crick e Maurice Wilkins receberam conjuntamente o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina por sua determinação da estrutura do DNA.

"Dogma central"

O modelo de Watson e Crick atraiu grande interesse imediatamente após sua apresentação. Chegando à sua conclusão em 21 de fevereiro de 1953, Watson e Crick fizeram seu primeiro anúncio em 28 de fevereiro. Em uma apresentação influente em 1957, Crick expôs o " dogma central da biologia molecular ", que predisse a relação entre DNA, RNA e proteínas e articulou a "hipótese da sequência". Uma confirmação crítica do mecanismo de replicação que estava implícito na estrutura helicoidal dupla seguida em 1958 na forma do experimento Meselson-Stahl . O trabalho de Crick e colaboradores mostrou que o código genético era baseado em tripletos de bases não sobrepostos, chamados códons, e Har Gobind Khorana e outros decifraram o código genético não muito tempo depois (1966). Essas descobertas representam o nascimento da biologia molecular .

História da estrutura terciária do RNA

Pré-história: a estrutura helicoidal do RNA

O primeiro trabalho em biologia estrutural de RNA coincidiu, mais ou menos, com o trabalho que estava sendo feito em DNA no início dos anos 1950. Em seu artigo seminal de 1953, Watson e Crick sugeriram que a aglomeração de van der Waals pelo grupo 2`OH da ribose impediria o RNA de adotar uma estrutura helicoidal dupla idêntica ao modelo que eles propuseram - o que agora conhecemos como DNA de forma B. Isso provocou questões sobre a estrutura tridimensional do RNA: essa molécula poderia formar algum tipo de estrutura helicoidal e, em caso afirmativo, como? Tal como acontece com o DNA, o trabalho estrutural inicial em RNA centrado em torno do isolamento de polímeros de RNA nativos para análise de difração de fibra. Em parte por causa da heterogeneidade das amostras testadas, os padrões de difração de fibra iniciais eram geralmente ambíguos e não prontamente interpretáveis. Em 1955, Marianne Grunberg-Manago e colegas publicaram um artigo descrevendo a enzima polinucleotídeo fosforilase , que clivava um grupo fosfato dos nucleotídeos difosfatos para catalisar sua polimerização. Esta descoberta permitiu aos pesquisadores sintetizar polímeros de nucleotídeos homogêneos, que então combinaram para produzir moléculas de fita dupla. Essas amostras produziram os padrões de difração de fibra mais prontamente interpretáveis ​​já obtidos, sugerindo uma estrutura helicoidal ordenada para RNA de dupla fita cognata que diferia daquela observada no DNA. Esses resultados abriram caminho para uma série de investigações sobre as várias propriedades e propensões do RNA. Até o final dos anos 1950 e início dos anos 1960, vários artigos foram publicados sobre vários tópicos na estrutura do RNA, incluindo hibridização de RNA-DNA, RNA de fita tripla e até mesmo cristalografia em pequena escala de di-nucleotídeos de RNA - GC e AU - em hélice primitiva. como arranjos. Para uma revisão mais aprofundada do trabalho inicial em biologia estrutural do RNA, consulte o artigo The Era of RNA Awakening: Structural biology of RNA in the first years, de Alexander Rich .

O começo: estrutura cristalina do tRNA PHE

Em meados da década de 1960, o papel do tRNA na síntese de proteínas estava sendo intensamente estudado. Nesse ponto, os ribossomos estavam envolvidos na síntese de proteínas, e foi demonstrado que uma fita de mRNA era necessária para a formação dessas estruturas. Em uma publicação de 1964, Warner e Rich mostraram que os ribossomos ativos na síntese de proteínas continham moléculas de tRNA ligadas aos sítios A e P e discutiram a noção de que essas moléculas auxiliam na reação da peptidil transferase . No entanto, apesar da caracterização bioquímica considerável, a base estrutural da função do tRNA permaneceu um mistério. Em 1965, Holley et al. purificou e sequenciou a primeira molécula de tRNA, propondo inicialmente que ela adotasse uma estrutura em folha de trevo, baseada em grande parte na capacidade de certas regiões da molécula de formar estruturas em alça de haste. O isolamento do tRNA provou ser o primeiro grande golpe inesperado na biologia estrutural do RNA. Após a publicação de Robert W. Holley , vários pesquisadores começaram a trabalhar no isolamento do tRNA para estudo cristalográfico, desenvolvendo métodos aprimorados para isolar a molécula à medida que trabalhavam. Em 1968, vários grupos haviam produzido cristais de tRNA, mas estes se mostraram de qualidade limitada e não produziam dados nas resoluções necessárias para determinar a estrutura. Em 1971, Kim et al. alcançou outro avanço, produzindo cristais de tRNA PHE de levedura que difratou para resoluções de 2-3 Ångström usando espermina , uma poliamina de ocorrência natural , que se ligou e estabilizou o tRNA. Apesar de ter cristais adequados, no entanto, a estrutura do tRNA PHE não foi resolvida imediatamente em alta resolução; em vez disso, foi preciso um trabalho pioneiro no uso de derivados de metais pesados ​​e muito mais tempo para produzir um mapa de densidade de alta qualidade de toda a molécula. Em 1973, Kim et al. produziram um mapa de 4 Ångström da molécula de tRNA no qual eles puderam rastrear inequivocamente todo o esqueleto. Esta solução seria seguida por muito mais, à medida que vários investigadores trabalharam para refinar a estrutura e, assim, elucidar mais detalhadamente os detalhes de emparelhamento de bases e interações de empilhamento, e validar a arquitetura publicada da molécula.

A estrutura do tRNA PHE é notável no campo da estrutura de ácido nucléico em geral, pois representou a primeira solução de uma estrutura de ácido nucléico de cadeia longa de qualquer tipo - RNA ou DNA - precedendo a solução de Richard E. Dickerson de um B- forma dodecamer por quase uma década. Além disso, o tRNA PHE demonstrou muitas das interações terciárias observadas na arquitetura do RNA que não seriam categorizadas e mais completamente compreendidas nos anos que viriam, fornecendo uma base para todas as futuras pesquisas estruturais do RNA.

O renascimento: a ribozima cabeça de martelo e o íntron do grupo I: P 4-6

Por um tempo considerável após as primeiras estruturas de tRNA, o campo da estrutura de RNA não avançou dramaticamente. A capacidade de estudar uma estrutura de RNA dependia do potencial de isolar o RNA alvo. Isso se provou limitado para o campo por muitos anos, em parte porque outros alvos conhecidos - ou seja, o ribossomo - eram significativamente mais difíceis de isolar e cristalizar. Além disso, porque outros alvos de RNA interessantes simplesmente não foram identificados, ou não foram suficientemente compreendidos para serem considerados interessantes, havia simplesmente uma falta de coisas para estudar estruturalmente. Como tal, por cerca de vinte anos após a publicação original da estrutura do tRNA PHE , as estruturas de apenas um punhado de outros alvos de RNA foram resolvidas, com quase todos pertencendo à família do RNA de transferência. Essa infeliz falta de escopo seria eventualmente superada em grande parte por causa de dois grandes avanços na pesquisa de ácido nucléico: a identificação de ribozimas e a capacidade de produzi-las por meio da transcrição in vitro .

Após a publicação de Tom Cech implicando o intron do grupo I de Tetrahymena como uma ribozima autocatalítica, e o relatório de Sidney Altman sobre a catálise por RNA da ribonuclease P , vários outros RNAs catalíticos foram identificados no final dos anos 1980, incluindo a ribozima de cabeça de martelo . Em 1994, McKay et al. publicou a estrutura de um ' complexo inibidor de ribozima de RNA-DNA de cabeça de martelo ' com resolução de 2,6 Ångström, no qual a atividade autocatalítica da ribozima foi interrompida por meio da ligação a um substrato de DNA. A conformação da ribozima publicada neste artigo acabou sendo mostrada como um dos vários estados possíveis e, embora essa amostra em particular fosse cataliticamente inativa, estruturas subsequentes revelaram sua arquitetura de estado ativo. Esta estrutura foi seguida pela publicação de Jennifer Doudna da estrutura dos domínios P4-P6 do intron do grupo I de Tetrahymena , um fragmento da ribozima originalmente tornada famosa por Cech. A segunda cláusula no título desta publicação - Principles of RNA Packing - evidencia de forma concisa o valor dessas duas estruturas: pela primeira vez, as comparações poderiam ser feitas entre estruturas de tRNA bem descritas e aquelas de RNAs globulares fora da família de transferência. Isso permitiu que a estrutura de categorização fosse construída para a estrutura terciária do RNA. Agora era possível propor a conservação de motivos, dobras e várias interações estabilizadoras locais. Para uma revisão inicial dessas estruturas e suas implicações, consulte RNA FOLDS: Insights from recent crystal structure , de Doudna e Ferre-D'Amare.

Além dos avanços feitos na determinação da estrutura global por meio da cristalografia, o início da década de 1990 também viu a implementação da RMN como uma técnica poderosa na biologia estrutural do RNA. Coincidente com as estruturas de ribozima em grande escala sendo resolvidas cristalograficamente, uma série de estruturas de pequenos RNAs e RNAs complexados com drogas e peptídeos foram resolvidos usando RMN. Além disso, NMR estava agora sendo usado para investigar e suplementar estruturas de cristal, como exemplificado pela determinação de uma estrutura de motivo tetraloop-receptor isolada publicada em 1997. Investigações como esta permitiram uma caracterização mais precisa das interações de emparelhamento de base e empilhamento de base que estabilizou as dobras globais de grandes moléculas de RNA. A importância de compreender os motivos estruturais terciários do RNA foi profeticamente bem descrita por Michel e Costa em sua publicação identificando o motivo tetraloop : "... não deveria ser uma surpresa se as moléculas de RNA auto-dobráveis ​​fizessem uso intensivo de apenas um conjunto de motivos terciários. Identificar esses motivos ajudaria muito as empresas de modelagem, que permanecerão essenciais enquanto a cristalização de grandes RNAs permanecer uma tarefa difícil ".

A era moderna: a era da biologia estrutural do RNA

O ressurgimento da biologia estrutural do RNA em meados da década de 1990 causou uma verdadeira explosão no campo da pesquisa estrutural dos ácidos nucléicos. Desde a publicação das estruturas do tubarão-martelo e P 4-6 , inúmeras contribuições importantes para o campo foram feitas. Alguns dos exemplos mais notáveis ​​incluem as estruturas dos íntrons do Grupo I e do Grupo II , e o Ribossomo resolvido por Nenad Ban e colegas no laboratório de Thomas Steitz . As três primeiras estruturas foram produzidas usando a transcrição in vitro , e a RMN desempenhou um papel na investigação de componentes parciais de todas as quatro estruturas - testamentos da indispensabilidade de ambas as técnicas para pesquisa de RNA. Mais recentemente, o Prêmio Nobel de Química de 2009 foi concedido a Ada Yonath , Venkatraman Ramakrishnan e Thomas Steitz por seu trabalho estrutural no ribossomo, demonstrando o papel proeminente que a biologia estrutural do RNA tem assumido na biologia molecular moderna.

História da bioquímica de proteínas

Primeiro isolamento e classificação

As proteínas foram reconhecidas como uma classe distinta de moléculas biológicas no século XVIII por Antoine Fourcroy e outros. Os membros dessa classe (chamados de "albuminoides", Eiweisskörper ou matières albuminoides ) eram reconhecidos por sua capacidade de coagular ou flocular sob vários tratamentos, como calor ou ácido; exemplos bem conhecidos no início do século XIX incluíam o albúmen de clara de ovo , albumina de soro sanguíneo , fibrina e glúten de trigo . A semelhança entre o cozimento da clara do ovo e a coalhada do leite era reconhecida mesmo nos tempos antigos; por exemplo, o nome albumen para a proteína da clara do ovo foi cunhado por Plínio, o Velho, do latim albus ovi (clara do ovo).

Com o conselho de Jöns Jakob Berzelius , o químico holandês Gerhardus Johannes Mulder realizou análises elementares de proteínas animais e vegetais comuns. Para a surpresa de todos, todas as proteínas tinham quase a mesma fórmula empírica , aproximadamente C 400 H 620 N 100 O 120 com átomos de enxofre e fósforo individuais. Mulder publicou suas descobertas em dois artigos (1837,1838) e formulou a hipótese de que havia uma substância básica ( Grundstoff ) das proteínas, e que ela era sintetizada pelas plantas e absorvida delas pelos animais na digestão. Berzelius foi um dos primeiros proponentes desta teoria e propôs o nome de "proteína" para esta substância em uma carta datada de 10 de julho de 1838

O nome proteína que ele propõe para o óxido orgânico de fibrina e albumina , eu queria derivar da [ palavra grega ] πρωτειος, porque parece ser a substância primitiva ou principal da nutrição animal.

Mulder passou a identificar os produtos de degradação de proteínas, tais como o amino ácido , leucina , para os quais ele encontrado um peso (quase correcta) molecular de 131 Da .

Purificações e medições de massa

O peso molecular mínimo sugerido pelas análises de Mulder foi de aproximadamente 9 kDa , centenas de vezes maior do que outras moléculas em estudo. Conseqüentemente, a estrutura química das proteínas (sua estrutura primária ) foi uma área ativa de pesquisa até 1949, quando Fred Sanger sequenciou a insulina . A teoria (correta) de que as proteínas eram polímeros lineares de aminoácidos ligados por ligações peptídicas foi proposta independente e simultaneamente por Franz Hofmeister e Emil Fischer na mesma conferência em 1902. No entanto, alguns cientistas estavam céticos de que tais macromoléculas longas pudessem ser estáveis ​​em solução . Consequentemente, numerosas teorias alternativas da proteína estrutura primária foram propostos, por exemplo, a hipótese coloidal que as proteínas eram conjuntos de moléculas pequenas, o cyclol hipótese de Dorothy Wrinch , a hipótese de dicetopiperazina de Emil Abderhalden e a hipótese pirrol / piperidina de Troensgard (1942) . A maioria dessas teorias tinha dificuldade em explicar o fato de que a digestão das proteínas produzia peptídeos e aminoácidos . As proteínas foram finalmente mostradas como macromoléculas de composição bem definida (e não misturas coloidais) por Theodor Svedberg usando ultracentrifugação analítica . A possibilidade de que algumas proteínas sejam associações não covalentes de tais macromoléculas foi mostrada por Gilbert Smithson Adair (medindo a pressão osmótica da hemoglobina ) e, posteriormente, por Frederic M. Richards em seus estudos da ribonuclease S. A espectrometria de massa das proteínas tem há muito tempo é uma técnica útil para identificar modificações pós-tradução e, mais recentemente, para sondar a estrutura da proteína.

A maioria das proteínas é difícil de purificar em quantidades superiores a miligramas, mesmo usando os métodos mais modernos. Portanto, os primeiros estudos se concentraram em proteínas que poderiam ser purificadas em grandes quantidades, por exemplo, as do sangue , clara do ovo , várias toxinas e enzimas digestivas / metabólicas obtidas em matadouros . Muitas técnicas de purificação de proteínas foram desenvolvidas durante a Segunda Guerra Mundial em um projeto liderado por Edwin Joseph Cohn para purificar proteínas do sangue para ajudar a manter os soldados vivos. No final dos anos 1950, a Armor Hot Dog Co. purificou 1 kg (= um milhão de miligramas) de ribonuclease A pancreática bovina pura e a disponibilizou a baixo custo para cientistas de todo o mundo. Esse ato generoso fez da RNase A a principal proteína para pesquisa básica nas décadas seguintes, resultando em vários prêmios Nobel.

Enrolamento de proteínas e primeiros modelos estruturais

O estudo do dobramento de proteínas começou em 1910 com um famoso artigo de Harriette Chick e CJ Martin , no qual eles mostraram que a floculação de uma proteína era composta por dois processos distintos: a precipitação de uma proteína a partir da solução foi precedida por outro processo denominado desnaturação , em que a proteína se tornou muito menos solúvel, perdeu sua atividade enzimática e tornou-se mais reativa quimicamente. Em meados da década de 1920, Tim Anson e Alfred Mirsky propuseram que a desnaturação era um processo reversível, uma hipótese correta que foi inicialmente satirizada por alguns cientistas como "desfiar o ovo". Anson também sugeriu que a desnaturação era um processo de dois estados ("tudo ou nada"), no qual uma transição molecular fundamental resultava em mudanças drásticas na solubilidade, atividade enzimática e reatividade química; ele observou ainda que as mudanças de energia livre na desnaturação eram muito menores do que aquelas tipicamente envolvidas em reações químicas. Em 1929, Hsien Wu levantou a hipótese de que a desnaturação era o desdobramento da proteína, uma mudança puramente conformacional que resultou na exposição das cadeias laterais de aminoácidos ao solvente. De acordo com essa hipótese (correta), a exposição das cadeias laterais alifáticas e reativas ao solvente tornava a proteína menos solúvel e mais reativa, enquanto a perda de uma conformação específica causava a perda da atividade enzimática. Embora considerada plausível, a hipótese de Wu não foi imediatamente aceita, uma vez que tão pouco se sabia sobre a estrutura e enzimologia da proteína e outros fatores poderiam ser responsáveis ​​pelas mudanças na solubilidade, atividade enzimática e reatividade química. No início dos anos 1960, Chris Anfinsen mostrou que o dobramento da ribonuclease A era totalmente reversível sem a necessidade de cofatores externos, verificando a "hipótese termodinâmica" do dobramento da proteína de que o estado dobrado representa o mínimo global de energia livre para a proteína.

A hipótese do dobramento de proteínas foi seguida por pesquisas sobre as interações físicas que estabilizam as estruturas de proteínas dobradas. O papel crucial das interações hidrofóbicas foi hipotetizado por Dorothy Wrinch e Irving Langmuir , como um mecanismo que pode estabilizar suas estruturas de ciclol . Embora apoiada por JD Bernal e outros, esta hipótese (correta) foi rejeitada junto com a hipótese do ciclol, que foi refutada na década de 1930 por Linus Pauling (entre outros). Em vez disso, Pauling defendeu a ideia de que a estrutura da proteína era estabilizada principalmente por ligações de hidrogênio , ideia proposta inicialmente por William Astbury (1933). Notavelmente, a teoria incorreta de Pauling sobre as ligações H resultou em seus modelos corretos para os elementos da estrutura secundária das proteínas, a hélice alfa e a folha beta . A interação hidrofóbica foi restaurada à sua correta proeminência por um famoso artigo em 1959 de Walter Kauzmann sobre desnaturação , baseado em parte no trabalho de Kaj Linderstrøm-Lang . A natureza iônica das proteínas foi demonstrada por Bjerrum, Weber e Arne Tiselius , mas Linderstrom-Lang mostrou que as cargas eram geralmente acessíveis ao solvente e não ligadas umas às outras (1949).

A estrutura secundária e terciária de baixa resolução das proteínas globulares foi investigada inicialmente por métodos hidrodinâmicos, como ultracentrifugação analítica e birrefringência de fluxo . Métodos espectroscópicos para sondar a estrutura da proteína (como dicroísmo circular , fluorescência, quase ultravioleta e absorbância infravermelha) foram desenvolvidos na década de 1950. As primeiras estruturas de resolução atômica das proteínas foram resolvidas por cristalografia de raios X na década de 1960 e por RMN na década de 1980. Em 2019, o Protein Data Bank tinha mais de 150.000 estruturas de resolução atômica de proteínas. Em tempos mais recentes, a microscopia crioeletrônica de grandes conjuntos macromoleculares alcançou resolução atômica, e a predição computacional da estrutura de proteínas de pequenos domínios de proteínas está se aproximando da resolução atômica.

Veja também

Referências

  • Fruton, Joseph. Proteins, Genes, Enzymes: The Interplay of Chemistry and Biology . New Haven: Yale University Press. 1999. ISBN  0-300-07608-8
  • Lily E. Kay , The Molecular Vision of Life: Caltech, a Fundação Rockefeller e o Rise of the New Biology , Oxford University Press, Reprint 1996
  • Morange, Michel. A History of Molecular Biology . Cambridge, MA: Harvard University Press. 1998.
  • Fry, Michael. Landmark Experiments in Molecular Biology . Amsterdam: Elsevier / Academic Press. 2016. ISBN: 978-0-802074-6