Cromatografia de afinidade - Affinity chromatography

A cromatografia de afinidade é um método de separação de uma biomolécula de uma mistura, com base em uma interação de ligação macromolecular altamente específica entre a biomolécula e outra substância. O tipo específico de interação de ligação depende da biomolécula de interesse; antígeno e anticorpo , enzima e substrato , receptor e ligante ou interações de ligação de proteína e ácido nucleico são frequentemente exploradas para isolamento de várias biomoléculas. A cromatografia de afinidade é útil por sua alta seletividade e resolução de separação, em comparação com outros métodos cromatográficos.

Princípio

A cromatografia de afinidade aproveita as interações de ligação específicas entre o analito de interesse (normalmente dissolvido na fase móvel ) e um parceiro de ligação ou ligante (imobilizado na fase estacionária ). Em um experimento típico de cromatografia de afinidade, o ligante é ligado a uma matriz sólida e insolúvel - geralmente um polímero como agarose ou poliacrilamida - quimicamente modificado para introduzir grupos funcionais reativos com os quais o ligante pode reagir, formando ligações covalentes estáveis. A fase estacionária é primeiro carregada em uma coluna na qual a fase móvel é introduzida. As moléculas que se ligam ao ligante permanecerão associadas à fase estacionária. Um tampão de lavagem é então aplicado para remover biomoléculas não-alvo interrompendo suas interações mais fracas com a fase estacionária, enquanto as biomoléculas de interesse permanecerão ligadas. As biomoléculas alvo podem então ser removidas aplicando um chamado tampão de eluição, que interrompe as interações entre as biomoléculas alvo ligadas e o ligante. A molécula alvo é assim recuperada na solução de eluição.

A cromatografia de afinidade não requer que o peso molecular, carga, hidrofobicidade ou outras propriedades físicas do analito de interesse sejam conhecidas, embora o conhecimento de suas propriedades de ligação seja útil no projeto de um protocolo de separação. Os tipos de interações de ligação comumente explorados em procedimentos de cromatografia de afinidade estão resumidos na tabela abaixo.

Interações biológicas típicas usadas em cromatografia de afinidade
Sr. Não Tipos de ligante Molécula alvo
1 Análogo de substrato Enzimas
2 Anticorpo Antígeno
3 Lectina Polissacarideo
4 Ácido nucleico Seqüência de base complementar
5 Hormônio Receptor
6 Avidin Biotina / molécula conjugada com biotina
7 Calmodulin Parceiro de ligação de calmodulina
8 Glutationa Proteína de fusão GST
9 Proteínas A e G Imunoglobulinas
10 Íons de metal Proteína de fusão de poli-histidina

Configurações de lote e coluna

Cromatografia em coluna
Cromatografia em lote

A ligação à fase sólida pode ser conseguida por cromatografia em coluna em que o meio sólido é empacotado em uma coluna, a mistura inicial executada através da coluna para permitir a sedimentação, um tampão de lavagem executado através da coluna e o tampão de eluição subsequentemente aplicado à coluna e coletado . Essas etapas geralmente são feitas à pressão ambiente. Alternativamente, a ligação pode ser alcançada usando um tratamento em lote, por exemplo, adicionando a mistura inicial à fase sólida em um recipiente, misturando, separando a fase sólida, removendo a fase líquida, lavando, centrifugando novamente, adicionando o tampão de eluição, centrifugação e remoção do eluto.

Às vezes, um método híbrido é empregado de modo que a ligação seja feita pelo método de lote, mas a fase sólida com a molécula alvo ligada é empacotada em uma coluna e a lavagem e a eluição são feitas na coluna.

Os ligantes usados ​​na cromatografia de afinidade são obtidos de fontes orgânicas e inorgânicas. Exemplos de fontes biológicas são proteínas séricas, lectinas e anticorpos. Fontes inorgânicas como atos idiotas, quelatos metálicos e corantes triazínicos.

Um terceiro método, absorção de leito expandido, que combina as vantagens dos dois métodos mencionados acima, também foi desenvolvido. As partículas da fase sólida são colocadas em uma coluna onde a fase líquida é bombeada do fundo e sai pelo topo. A gravidade das partículas garante que a fase sólida não saia da coluna com a fase líquida.

As colunas de afinidade podem ser eluídas alterando as concentrações de sal, pH, pI, carga e força iônica diretamente ou por meio de um gradiente para resolver as partículas de interesse.

Mais recentemente, foram desenvolvidas configurações que empregam mais de uma coluna em série. A vantagem em comparação com configurações de coluna única é que o material de resina pode ser totalmente carregado, uma vez que o produto não vinculativo é passado diretamente para uma coluna consecutiva com material de coluna novo. Esses processos cromatográficos são conhecidos como cromatografia contra-corrente periódica (PCC). Os custos da resina por quantidade de produto produzido podem ser drasticamente reduzidos. Uma vez que uma coluna sempre pode ser eluída e regenerada enquanto a outra coluna é carregada, já duas colunas são suficientes para fazer pleno uso das vantagens. Colunas adicionais podem fornecer flexibilidade adicional para tempos de eluição e regeneração, ao custo de equipamentos adicionais e custos de resina.

Usos específicos

A cromatografia de afinidade pode ser usada em uma série de aplicações, incluindo purificação de ácido nucleico, purificação de proteína de extratos livres de células e purificação de sangue.

Usando a cromatografia de afinidade, pode-se separar proteínas que se ligam a um determinado fragmento de proteínas que não se ligam a esse fragmento específico. Como essa técnica de purificação depende das propriedades biológicas da proteína necessária, é uma técnica útil e as proteínas podem ser purificadas muitas vezes em uma única etapa.

Vários meios de afinidade

Existem muitos meios de afinidade diferentes para uma variedade de usos possíveis. Resumidamente, eles são (generalizados) ativados / funcionalizados que funcionam como um espaçador funcional, matriz de suporte e elimina o manuseio de reagentes tóxicos.

O meio de aminoácidos é usado com uma variedade de proteínas, proteínas, peptídeos e enzimas séricas, bem como rRNA e dsDNA. O meio de biotina avidina é usado no processo de purificação de biotina / avidina e seus derivados.

A ligação de carboidratos é mais frequentemente usada com glicoproteínas ou qualquer outra substância que contenha carboidratos; carboidrato é usado com lectinas, glicoproteínas ou qualquer outra proteína metabólica de carboidrato. O meio de ligante corante é inespecífico, mas imita substratos biológicos e proteínas. A glutationa é útil para a separação de proteínas recombinantes marcadas com GST. A heparina é um ligante de afinidade generalizado e é mais útil para a separação de proteínas de coagulação do plasma, junto com enzimas de ácido nucleico e lipases

Os meios de interação hidrofóbicos são mais comumente usados ​​para direcionar grupos carboxila livres e proteínas.

Meios de imunoafinidade (detalhados abaixo) utilizam alta especificidade de antígenos e anticorpos para separar; a cromatografia de afinidade de metal imobilizado é detalhada abaixo e usa interações entre íons de metal e proteínas (geralmente marcados especialmente) para separar; nucleotídeo / coenzima que funciona para separar desidrogenases, quinases e transaminases.

Os ácidos nucleicos funcionam para capturar mRNA, DNA, rRNA e outros ácidos nucleicos / oligonucleotídeos. O método da proteína A / G é usado para purificar imunoglobulinas.

Os meios especiais são projetados para uma classe ou tipo específico de proteína / coenzima; este tipo de mídia só funcionará para separar uma proteína ou coenzima específica.

Imunoafinidade

Outro uso para o procedimento é a purificação por afinidade de anticorpos do soro sanguíneo. Se o soro é conhecido por conter anticorpos contra um antígeno específico (por exemplo, se o soro vem de um organismo imunizado contra o antígeno em questão), ele pode ser usado para a purificação por afinidade desse antígeno. Isso também é conhecido como cromatografia de imunoafinidade. Por exemplo, se um organismo for imunizado contra uma proteína de fusão GST, ele produzirá anticorpos contra a proteína de fusão e, possivelmente, também anticorpos contra a etiqueta GST. A proteína pode então ser acoplada covalentemente a um suporte sólido, tal como agarose e usada como um ligante de afinidade em purificações de anticorpos de soro imune.

Para eficácia, a proteína GST e a proteína de fusão GST podem ser acopladas separadamente. O soro é inicialmente permitido ligar-se à matriz de afinidade GST. Isso removerá os anticorpos contra a parte GST da proteína de fusão. O soro é então separado do suporte sólido e pode ligar-se à matriz da proteína de fusão GST. Isso permite que quaisquer anticorpos que reconheçam o antígeno sejam capturados no suporte sólido. A eluição dos anticorpos de interesse é mais frequentemente alcançada usando um tampão de baixo pH , como glicina pH 2,8. O eluato é coletado em um tampão de tris ou fosfato neutro , para neutralizar o tampão de eluição de baixo pH e interromper qualquer degradação da atividade do anticorpo. Este é um bom exemplo, pois a purificação por afinidade é usada para purificar a proteína de fusão GST inicial, para remover os anticorpos anti-GST indesejáveis ​​do soro e para purificar o anticorpo alvo.

Os anticorpos monoclonais também podem ser selecionados para se ligar a proteínas com grande especificidade, onde a proteína é liberada em condições bastante suaves. Isso pode ser útil para pesquisas futuras.

Uma estratégia simplificada é freqüentemente empregada para purificar anticorpos gerados contra antígenos peptídicos . Quando os antígenos peptídicos são produzidos sinteticamente, um resíduo de cisteína terminal é adicionado ao terminal N ou C do peptídeo. Este resíduo de cisteína contém um grupo funcional sulfidrila que permite que o peptídeo seja facilmente conjugado a uma proteína transportadora (por exemplo, hemocianina de lapa (KLH)). O mesmo peptídeo contendo cisteína também é imobilizado em uma resina de agarose através do resíduo de cisteína e é então usado para purificar o anticorpo.

A maioria dos anticorpos monoclonais foi purificada usando cromatografia de afinidade baseada em Proteína A ou Proteína G específica de imunoglobulina , derivada de bactérias.

A cromatografia de imunoafinidade com anticorpos monoclonais imobilizados em coluna monolítica foi usada com sucesso para capturar vesículas extracelulares (por exemplo, exossomos e exômeros) do plasma de sangue humano, visando tetraspaninas e integrinas encontradas na superfície dos EVs.

A cromatografia de imunoafinidade também é a base para tiras de teste imunocromatográfico (ICT), que fornecem um meio rápido de diagnóstico no atendimento ao paciente. Usando a ICT, um técnico pode fazer uma determinação à beira do leito do paciente, sem a necessidade de um laboratório. A detecção de ICT é altamente específica para o micróbio que causa uma infecção.

Cromatografia de afinidade de íon metálico imobilizado

A cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) é baseada na ligação covalente coordenada específica de aminoácidos, particularmente histidina, aos metais. Esta técnica funciona permitindo que proteínas com afinidade por íons metálicos sejam retidas em uma coluna contendo íons metálicos imobilizados, como cobalto, níquel ou cobre para a purificação de proteínas ou peptídeos contendo histidina, ferro, zinco ou gálio para a purificação de proteínas ou peptídeos fosforilados. Muitas proteínas de ocorrência natural não têm afinidade para íons metálicos, portanto, a tecnologia de DNA recombinante pode ser usada para introduzir tal etiqueta de proteína no gene relevante. Os métodos usados ​​para eluir a proteína de interesse incluem alterar o pH ou adicionar uma molécula competitiva, como o imidazol .

Uma coluna de cromatografia contendo esferas de agarose de níquel usadas para purificação de proteínas com marcadores de histidina

Proteínas recombinantes

Possivelmente, o uso mais comum da cromatografia de afinidade é para a purificação de proteínas recombinantes. Proteínas com afinidade conhecida são marcadas com proteínas para auxiliar na sua purificação. A proteína pode ter sido geneticamente modificada de modo a permitir que seja selecionada para ligação por afinidade; isso é conhecido como uma proteína de fusão. Os marcadores incluem hexahistidina ( His ), glutationa -S-transferase (GST) e proteína de ligação à maltose (MBP). Os marcadores de histidina têm afinidade por íons de níquel , cobalto , zinco , cobre e ferro que foram imobilizados formando ligações covalentes coordenadas com um quelante incorporado na fase estacionária. Para a eluição, é utilizada uma quantidade em excesso de um composto capaz de atuar como um ligante de íon metálico, como o imidazol . GST tem uma afinidade para a glutationa, que está comercialmente disponível imobilizada como agarose de glutationa. Durante a eluição, o excesso de glutationa é usado para deslocar a proteína marcada.

Lectinas

A cromatografia de afinidade com lectina é uma forma de cromatografia de afinidade em que as lectinas são usadas para separar componentes dentro da amostra. Lectinas, como a concanavalina A, são proteínas que podem se ligar a moléculas de carboidratos alfa-D-manose e alfa-D-glicose específicas. Algumas moléculas de carboidratos comuns usadas na cromatografia de afinidade com lectina são Con A-Sepharose e WGA-agarose. Outro exemplo de lectina é a aglutinina de gérmen de trigo que se liga a DN-acetil-glucosamina. A aplicação mais comum é separar glicoproteínas de proteínas não glicosiladas ou uma glicoforma de outra glicoforma. Embora existam várias maneiras de realizar a cromatografia de afinidade com a lectina, o objetivo é extrair um ligante de açúcar da proteína desejada.

Especialidade

Outro uso para cromatografia de afinidade é a purificação de proteínas específicas usando uma matriz de gel que é única para uma proteína específica. Por exemplo, a purificação de β-galactosidase de E. coli é realizada por cromatografia de afinidade usando p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarose como a matriz de afinidade. A p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarose é usada como a matriz de afinidade porque contém um grupo galactopiranosil, que serve como um bom substrato análogo para E. coli-B-Galactosidase. Esta propriedade permite que a enzima se ligue à fase estacionária da matriz de afinidade e seja eluída pela adição de concentrações crescentes de sal à coluna.

Fosfatase alcalina

A fosfatase alcalina de E. coli pode ser purificada usando uma matriz DEAE-Celulose. A. fosfatase tem uma leve carga negativa, permitindo que se ligue fracamente aos grupos amina carregados positivamente na matriz. A enzima pode então ser eluída pela adição de tampão com concentrações de sal mais altas.

Cromatografia de afinidade de boronato

A cromatografia de afinidade com boronato consiste no uso de ácido borônico ou boronatos para eluir e quantificar as quantidades de glicoproteínas . Adaptações clínicas têm aplicado este tipo de cromatografia para uso na determinação da avaliação de longo prazo de pacientes diabéticos por meio da análise de sua hemoglobina glicada .

Purificação de albumina sérica

Dos muitos usos da cromatografia de afinidade, um deles é visto na purificação por afinidade de albumina e contaminação por macroglobulina. Este tipo de purificação é útil para remover o excesso de albumina e? 2 contaminação macroglobulina, ao realizar a espectrometria de massa. Na purificação por afinidade de albumina sérica, o estacionário usado para coletar ou atrair proteínas séricas pode ser Cibacron Blue-Sepharose. Em seguida, as proteínas séricas podem ser eluídas do adsorvente com um tampão contendo tiocianato (SCN - ).

Cromatografia de afinidade fraca

A cromatografia de afinidade fraca (WAC) é uma técnica de cromatografia de afinidade para a triagem de afinidade no desenvolvimento de drogas. WAC é uma técnica de cromatografia líquida baseada em afinidade que separa compostos químicos com base em suas diferentes afinidades fracas com um alvo imobilizado. Quanto maior a afinidade de um composto para o alvo, mais tempo ele permanece na unidade de separação e isso será expresso como um tempo de retenção mais longo. A medida de afinidade e a classificação de afinidade podem ser alcançadas processando os tempos de retenção obtidos dos compostos analisados.

A tecnologia WAC é demonstrada contra uma série de alvos proteicos diferentes - proteases , quinases , chaperonas e alvos de interação proteína-proteína (PPI). O WAC demonstrou ser mais eficaz do que os métodos estabelecidos para a triagem baseada em fragmentos.

História

A cromatografia de afinidade foi concebida e desenvolvida por Pedro Cuatrecasas e Meir Wilchek .

Referências

links externos

"Princípio de cromatografia de afinidade, procedimento e nota detalhada avançada - 2020".