Rotulagem Immunogold - Immunogold labelling

Duas imagens produzidas usando a marcação imunogold e microscopia eletrônica de transmissão: (A) partículas de ouro estão marcando mtDNA próximo à mitocôndria (B) mtDNA marcado com partículas de ouro após a extração.

A marcação com Immunogold ou coloração com Immunogold (IGS) é uma técnica de coloração usada em microscopia eletrônica . Esta técnica de coloração é equivalente à técnica de imunofluorescência indireta para luz visível. Partículas de ouro coloidal são mais frequentemente ligadas a anticorpos secundários que, por sua vez, são ligados a anticorpos primários projetados para se ligar a um antígeno específico ou outro componente celular . O ouro é usado por sua alta densidade de elétrons, que aumenta a dispersão de elétrons para dar 'manchas escuras' de alto contraste.

Usada pela primeira vez em 1971, a marcação imunogold foi aplicada tanto à microscopia eletrônica de transmissão quanto à microscopia eletrônica de varredura , bem como à microscopia de campo claro . A técnica de rotulagem pode ser adaptada para distinguir vários objetos usando partículas de ouro de tamanhos diferentes.

A etiquetagem imunogold pode introduzir artefatos, pois as partículas de ouro residem a alguma distância do objeto etiquetado e um corte muito fino é necessário durante a preparação da amostra.

História

A marcação Immunogold foi usada pela primeira vez em 1971 por Faulk e Taylor para identificar antígenos de Salmonella . Foi aplicado pela primeira vez em microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e foi especialmente útil para destacar proteínas encontradas em baixas densidades, como alguns antígenos de superfície celular. À medida que a resolução da microscopia eletrônica de varredura (SEM) aumentava, também aumentava a necessidade de rótulos do tamanho de nanopartículas, como o immunogold. Em 1975, Horisberger e colegas de trabalho visualizaram com sucesso nanopartículas de ouro com um diâmetro inferior a 30 nm e isso logo se tornou uma técnica de SEM estabelecida.

Técnica

Primeiro, uma seção fina da amostra é cortada, geralmente usando um micrótomo . Vários outros estágios de preparação da amostra podem então ocorrer.

A amostra preparada é então incubada com um anticorpo específico projetado para se ligar à molécula de interesse. Em seguida, um anticorpo secundário que possui partículas de ouro anexadas é adicionado e se liga ao anticorpo primário. O ouro também pode ser ligado à proteína A ou à proteína G em vez de um anticorpo secundário, uma vez que essas proteínas se ligam às regiões Fc da IgG de mamíferos de uma forma não específica.

A partícula de ouro com densidade de elétrons agora pode ser vista em um microscópio eletrônico como um ponto preto, rotulando indiretamente a molécula de interesse.

Rotulando vários objetos

A marcação Immunogold pode ser usada para visualizar mais de um alvo simultaneamente. Isso pode ser alcançado em microscopia eletrônica , usando duas partículas de ouro de tamanhos diferentes. Uma extensão deste método usou três partículas de ouro de tamanhos diferentes para rastrear a localização de peptídeos reguladores . Um método mais complexo de rotulagem multi-site envolve rotular lados opostos de um sítio antigênico separadamente, as partículas de ouro imune anexadas a ambos os lados podem então ser vistas simultaneamente.

Usos em microscopia de campo claro

Embora a etiquetagem imunogold seja normalmente usada para microscopia eletrônica de transmissão, quando o ouro é 'realçado pela prata', ele pode ser visto usando microscopia de campo claro . O realce de prata aumenta o tamanho da partícula, tornando também possível a microscopia eletrônica de varredura. A fim de produzir as partículas de ouro aprimoradas com prata, as partículas de ouro coloidal são colocadas em uma solução de intensificação ácida contendo íons de prata . As partículas de ouro agem então como um local de nucleação e a prata é depositada na partícula. Um exemplo da aplicação da marcação por imunogoldagem intensificada com prata (IGSS) foi na identificação do patógeno Erwinia amylovora .

Limitações

Uma limitação inerente à técnica de immunogold é que a partícula de ouro está cerca de 15-30 nm de distância do local ao qual o anticorpo primário está ligado (ao usar uma estratégia de marcação de anticorpos primários e secundários ). A localização precisa da molécula alvo não pode, portanto, ser calculada com precisão. As partículas de ouro podem ser criadas com um diâmetro de 1  nm (ou inferior), mas outra limitação é então percebida - nesses tamanhos, o rótulo de ouro torna-se difícil de distinguir da estrutura do tecido.

Seções finas são necessárias para a rotulagem imunogold e podem produzir imagens enganosas; uma fatia fina de um componente de célula pode não fornecer uma visão precisa de sua estrutura tridimensional . Por exemplo, um microtúbulo pode aparecer como um 'pico' dependendo do plano em que ocorreu o seccionamento. Para superar esta limitação, seções seriais podem ser tomadas, que podem então ser compiladas em uma imagem tridimensional .

Outra limitação é que os anticorpos e as partículas de ouro não podem penetrar na resina usada para incorporar as amostras para geração de imagens. Assim, apenas moléculas acessíveis podem ser direcionadas e visualizadas. A rotulagem antes de incorporar a amostra pode reduzir o impacto negativo desta limitação.

Veja também

Referências