Imunocoloração - Immunostaining

Micrografia de uma seção imunocorada de GFAP de um tumor cerebral .

Em bioquímica , a imunocoloração é qualquer uso de um método baseado em anticorpos para detectar uma proteína específica em uma amostra. O termo "imunocoloração" foi originalmente usado para se referir à coloração imuno-histoquímica de seções de tecido, conforme descrito pela primeira vez por Albert Coons em 1941. No entanto, a imunocoloração agora abrange uma ampla gama de técnicas usadas em histologia , biologia celular e biologia molecular que usam anticorpos métodos de coloração baseados em

Técnicas

Imunohistoquímica

A imunohistoquímica ou coloração IHQ de seções de tecido (ou imunocitoquímica , que é a coloração de células ), é talvez a técnica de imunocoloração mais comumente aplicada. Enquanto os primeiros casos de coloração IHC usavam corantes fluorescentes (veja imunofluorescência ), outros métodos não fluorescentes usando enzimas como peroxidase (veja coloração por imunoperoxidase ) e fosfatase alcalina são agora usados. Essas enzimas são capazes de catalisar reações que geram um produto colorido facilmente detectável por microscopia de luz . Alternativamente, elementos radioativos podem ser usados como marcadores, e a imunorreação pode ser visualizada por autorradiografia .

A preparação ou fixação do tecido é essencial para a preservação da morfologia celular e da arquitetura do tecido. A fixação inadequada ou prolongada pode diminuir significativamente a capacidade de ligação do anticorpo. Muitos antígenos pode ser demonstrado com sucesso em formalina -Fixed parafina secções de tecido -embedded. No entanto, alguns antígenos não sobreviverão até mesmo por quantidades moderadas de fixação de aldeído. Nessas condições, os tecidos devem ser congelados rapidamente em nitrogênio líquido e cortados com um criostato. As desvantagens das seções congeladas incluem morfologia pobre, resolução pobre em ampliações maiores, dificuldade em cortar seções de parafina e a necessidade de armazenamento congelado. Alternativamente, as seções de vibratome não requerem que o tecido seja processado por meio de solventes orgânicos ou alto calor, o que pode destruir a antigenicidade ou ser interrompido por congelamento e descongelamento. A desvantagem das seções de vibratome é que o processo de corte é lento e difícil com tecidos moles e mal fixados, e que marcas de vibração ou linhas de vibratome são freqüentemente aparentes nas seções.

A detecção de muitos antígenos pode ser dramaticamente melhorada por métodos de recuperação de antígenos que atuam quebrando algumas das ligações cruzadas de proteínas formadas pela fixação para descobrir sítios antigênicos ocultos. Isso pode ser realizado por aquecimento por vários períodos de tempo (recuperação de epítopo induzida por calor ou HIER) ou usando digestão enzimática (recuperação de epítopo induzida por proteolítica ou PIER).

Uma das principais dificuldades com a coloração IHC é superar o background específico ou não específico. Otimização de métodos e tempos de fixação, pré-tratamento com agentes bloqueadores, incubação de anticorpos com alto teor de sal e otimização de buffers e tempos de lavagem pós-anticorpo são todos importantes para a obtenção de imunocoloração de alta qualidade. Além disso, a presença de controles positivos e negativos para a coloração são essenciais para determinar a especificidade.

Citometria de fluxo

Um citômetro de fluxo pode ser usado para a análise direta de células que expressam uma ou mais proteínas específicas. As células são imunocoradas em solução usando métodos semelhantes aos usados para imunofluorescência e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo.

A citometria de fluxo tem várias vantagens sobre IHC, incluindo: a capacidade de definir populações de células distintas por seu tamanho e granularidade; a capacidade de bloquear células mortas; sensibilidade melhorada; e análise multicor para medir vários antígenos simultaneamente. No entanto, a citometria de fluxo pode ser menos eficaz na detecção de populações de células extremamente raras e há uma perda de relações arquitetônicas na ausência de uma seção de tecido. A citometria de fluxo também tem um alto custo de capital associado à compra de um citômetro de fluxo.

Western blotting

O Western blotting permite a detecção de proteínas específicas de extratos feitos de células ou tecidos, antes ou depois de quaisquer etapas de purificação . As proteínas são geralmente separadas por tamanho usando eletroforese em gel antes de serem transferidas para uma membrana sintética por meio de métodos secos, semi-secos ou úmidos. A membrana pode então ser sondada usando anticorpos usando métodos semelhantes à imunohistoquímica, mas sem a necessidade de fixação. A detecção é normalmente realizada usando anticorpos ligados a peroxidase para catalisar uma reação quimioluminescente .

O Western blotting é um método de biologia molecular de rotina que pode ser usado para comparar semiquantitativamente os níveis de proteína entre os extratos. A separação de tamanhos antes da transferência permite que o peso molecular da proteína seja medido em comparação com marcadores de peso molecular conhecidos.

Ensaio de imunoabsorção enzimática

O ensaio de imunoabsorção enzimática ou ELISA é um método de diagnóstico para determinação quantitativa ou semiquantitativa das concentrações de proteínas do plasma sanguíneo , soro ou extratos de células / tecidos em um formato de placa de múltiplos poços (geralmente 96 poços por placa). Em geral, as proteínas em solução são adsorvidas em placas de ELISA. Os anticorpos específicos para a proteína de interesse são usados para sondar a placa. O fundo é minimizado pela otimização dos métodos de bloqueio e lavagem (como para IHC), e a especificidade é garantida pela presença de controles positivos e negativos. Os métodos de detecção são geralmente colorimétricos ou baseados em quimioluminescência.

Microscopia imunoeletrônica

A microscopia eletrônica ou EM pode ser usada para estudar a microarquitetura detalhada de tecidos ou células. O Immuno-EM permite a detecção de proteínas específicas em cortes de tecido ultrafinos. Anticorpos marcados com partículas de metal pesado (por exemplo, ouro) podem ser visualizados diretamente usando microscopia eletrônica de transmissão . Embora poderoso na detecção da localização subcelular de uma proteína, o imuno-EM pode ser tecnicamente desafiador, caro e requer uma otimização rigorosa dos métodos de fixação e processamento de tecidos. A biotinilação de proteínas in vivo foi proposta para aliviar os problemas causados pela frequente incompatibilidade de coloração de anticorpos com protocolos de fixação que melhor preservam a morfologia celular.

Visão geral metodológica

Em métodos de imunocoloração, um anticorpo é usado para detectar um epítopo de proteína específico . Esses anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais . A detecção deste primeiro anticorpo ou anticorpo primário pode ser realizada de várias maneiras.

O anticorpo primário pode ser marcado diretamente usando uma enzima ou fluoróforo .
O anticorpo primário pode ser marcado usando uma pequena molécula que interage com um parceiro de ligação de alta afinidade que pode ser ligado a uma enzima ou fluoróforo. A biotina - estreptavidina é uma interação de alta afinidade comumente usada.
O anticorpo primário pode ser sondado para usar um anticorpo secundário específico de espécie mais amplo que é marcado usando uma enzima ou fluoróforo.
No caso da microscopia eletrônica , os anticorpos estão ligados a uma partícula de metal pesado (normalmente nanopartículas de ouro no intervalo de 5-15 nm de diâmetro).

Conforme descrito anteriormente, enzimas como peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina são comumente usadas para catalisar reações que dão um produto colorido ou quimioluminescente . As moléculas fluorescentes podem ser visualizadas usando microscopia de fluorescência ou microscopia confocal .

Formulários

As aplicações da imunocoloração são numerosas, mas são mais comumente usadas em diagnósticos clínicos e pesquisas laboratoriais .

Clinicamente, o IHC é usado em histopatologia para o diagnóstico de tipos específicos de câncer com base em marcadores moleculares.

Em ciência de laboratório, a imunocoloração pode ser usada para uma variedade de aplicações com base na investigação da presença ou ausência de uma proteína, sua distribuição nos tecidos, sua localização subcelular e mudanças na expressão ou degradação da proteína.

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