Diagnóstico molecular - Molecular diagnostics
O diagnóstico molecular é uma coleção de técnicas usadas para analisar marcadores biológicos no genoma e proteoma , e como suas células expressam seus genes como proteínas , aplicando a biologia molecular a testes médicos . Na medicina, a técnica é usada para diagnosticar e monitorar doenças, detectar riscos e decidir quais terapias funcionarão melhor para pacientes individuais, e na biossegurança agrícola da mesma forma para monitorar doenças em lavouras e rebanhos , estimar riscos e decidir quais medidas de quarentena devem ser tomadas .
Ao analisar as especificidades do paciente e de sua doença, o diagnóstico molecular oferece a perspectiva de uma medicina personalizada . Esses testes são úteis em uma variedade de especialidades médicas , incluindo doenças infecciosas , oncologia , tipagem de antígeno leucocitário humano (que investiga e prevê a função imunológica ), coagulação e farmacogenômica - a previsão genética de quais drogas funcionarão melhor. Eles se sobrepõem à química clínica (testes médicos em fluidos corporais).
História
O campo da biologia molecular cresceu no final do século XX, assim como sua aplicação clínica. Em 1980, Yuet Wai Kan et al . sugeriram um teste genético pré-natal para talassemia que não dependia do sequenciamento de DNA - então em sua infância - mas de enzimas de restrição que cortam o DNA onde reconheceram sequências curtas específicas, criando diferentes comprimentos de fita de DNA dependendo de qual alelo (variação genética) o feto possuído. Na década de 1980, a frase foi usada em nomes de empresas como Molecular Diagnostics Incorporated e Bethseda Research Laboraties Molecular Diagnostics .
Durante a década de 1990, a identificação de genes recém-descobertos e novas técnicas de sequenciamento de DNA levaram ao surgimento de um campo distinto da medicina laboratorial molecular e genômica; em 1995, a Association for Molecular Pathology (AMP) foi formada para lhe dar estrutura. Em 1999, a AMP foi cofundadora do The Journal of Medical Diagnostics . A Informa Healthcare lançou o Expert Reviews in Medical Diagnostics em 2001. De 2002 em diante, o HapMap Project agregou informações sobre as diferenças genéticas de uma letra que se repetem na população humana - os polimorfismos de nucleotídeo único - e sua relação com a doença. Em 2012, as técnicas de diagnóstico molecular para talassemia usam testes de hibridização genética para identificar o polimorfismo de nucleotídeo único específico que causa a doença de um indivíduo.
À medida que a aplicação comercial do diagnóstico molecular se tornou mais importante, também se tornou mais importante o debate sobre o patenteamento das descobertas genéticas em seu cerne . Em 1998, a União Europeia da Directiva 98/44 / ECclarified que as patentes de sequências de ADN foram admissível. Em 2010, nos Estados Unidos, a AMP processou a Myriad Genetics para contestar as patentes desta última em relação a dois genes, BRCA1 e BRCA2 , que estão associados ao câncer de mama. Em 2013, a Suprema Corte dos Estados Unidos concordou parcialmente , determinando que uma sequência de genes de ocorrência natural não poderia ser patenteada.
Técnicas
Desenvolvimento a partir de ferramentas de pesquisa
A industrialização de ferramentas de ensaio de biologia molecular tornou prático seu uso em clínicas. A miniaturização em um único dispositivo portátil pode trazer diagnósticos médicos para a clínica e para o escritório ou casa. O laboratório clínico exige altos padrões de confiabilidade; diagnósticos podem exigir acreditação ou enquadrar-se nos regulamentos de dispositivos médicos. A partir de 2011, alguns laboratórios clínicos dos Estados Unidos, no entanto, usavam ensaios vendidos para "uso exclusivo em pesquisa".
Processos de laboratório precisam aderir aos regulamentos, como os clínicos Alterações Laboratory Improvement , Health Insurance Portability e Accountability Act , Boas Práticas de Laboratório , e Food and Drug Administration especificações nos Estados Unidos. Os Sistemas de Gerenciamento de Informações Laboratoriais ajudam a rastrear esses processos. O regulamento se aplica tanto ao pessoal quanto aos suprimentos. Em 2012, doze estados dos EUA exigem que os patologistas moleculares sejam licenciados; vários conselhos, como o American Board of Medical Genetics e o American Board of Pathology, certificam tecnólogos, supervisores e diretores de laboratório.
A automação e o código de barras da amostra maximizam o rendimento e reduzem a possibilidade de erro ou contaminação durante o manuseio manual e relatórios de resultados. Dispositivos individuais para fazer o ensaio do início ao fim estão agora disponíveis.
Ensaios
O diagnóstico molecular usa ensaios biológicos in vitro , como PCR- ELISA ou hibridização in situ com fluorescência . O ensaio detecta uma molécula, muitas vezes em baixas concentrações, que é um marcador de doença ou risco em uma amostra retirada de um paciente. A preservação da amostra antes da análise é crítica. O manuseio manual deve ser minimizado. A frágil molécula de RNA apresenta certos desafios. Como parte do processo celular de expressão de genes como proteínas, ele oferece uma medida da expressão gênica, mas é vulnerável à hidrólise e à quebra por enzimas RNAse sempre presentes . As amostras podem ser congeladas rapidamente em nitrogênio líquido ou incubadas em agentes de preservação.
Como os métodos de diagnóstico molecular podem detectar marcadores sensíveis, esses testes são menos intrusivos do que uma biópsia tradicional . Por exemplo, como os ácidos nucléicos livres de células existem no plasma humano , uma simples amostra de sangue pode ser suficiente para obter informações genéticas de tumores, transplantes ou de um feto. Muitos, mas não todos, os métodos de diagnóstico molecular baseados na detecção de ácidos nucleicos usam a reação em cadeia da polimerase (PCR) para aumentar enormemente o número de moléculas de ácido nucleico, amplificando assim a (s) sequência (s) alvo na amostra do paciente. PCR é um método em que um molde de DNA é amplificado usando primers sintéticos, uma DNA polimerase e dNTPs. A mistura é submetida a ciclos entre pelo menos 2 temperaturas: uma temperatura alta para desnaturar o DNA de fita dupla em moléculas de fita simples e uma temperatura baixa para o primer hibridizar com o molde e para a polimerase estender o primer. Cada ciclo de temperatura, teoricamente, dobra a quantidade da sequência alvo. A detecção de variações de sequência usando PCR normalmente envolve o projeto e o uso de reagentes oligonucleotídicos que amplificam a variante de interesse de forma mais eficiente do que a sequência de tipo selvagem. A PCR é atualmente o método mais utilizado para a detecção de sequências de DNA. A detecção do marcador pode usar PCR em tempo real, sequenciamento direto, chips de microarray - chips pré-fabricados que testam muitos marcadores de uma vez ou MALDI-TOF. O mesmo princípio se aplica ao proteoma e ao genoma . Matrizes de proteínas de alto rendimento podem usar DNA complementar ou anticorpos para se ligar e, portanto, podem detectar muitas proteínas diferentes em paralelo. Os testes de diagnóstico molecular variam amplamente em sensibilidade, tempo de resposta, custo, cobertura e aprovação regulatória. Eles também variam no nível de validação aplicada nos laboratórios que os utilizam. Portanto, é necessária uma validação local robusta de acordo com os requisitos regulamentares e o uso de controles apropriados, especialmente quando o resultado pode ser usado para informar uma decisão de tratamento do paciente.
Benefícios
Pré-natal
Os testes pré-natais convencionais para anomalias cromossômicas , como a Síndrome de Down, baseiam-se na análise do número e da aparência dos cromossomos - o cariótipo . Os testes de diagnóstico molecular, como o teste de hibridização genômica comparativa de microarray , em vez de uma amostra de DNA, e por causa do DNA livre de células no plasma, poderiam ser menos invasivos, mas desde 2013 ainda é um complemento aos testes convencionais.
Tratamento
Alguns dos polimorfismos de nucleotídeo único de um paciente - pequenas diferenças em seu DNA - podem ajudar a prever a rapidez com que metabolizarão determinados medicamentos; isso é chamado de farmacogenômica . Por exemplo, a enzima CYP2C19 metaboliza várias drogas, como o anticoagulante Clopidogrel , em suas formas ativas. Alguns pacientes possuem polimorfismos em locais específicos no gene 2C19 que são metabolizadores fracos dessas drogas; os médicos podem testar esses polimorfismos e descobrir se os medicamentos serão totalmente eficazes para aquele paciente. Os avanços na biologia molecular ajudaram a mostrar que algumas síndromes que antes eram classificadas como uma única doença são, na verdade, vários subtipos com causas e tratamentos totalmente diferentes. O diagnóstico molecular pode ajudar a diagnosticar o subtipo - por exemplo, de infecções e cânceres - ou a análise genética de uma doença com um componente hereditário, como a síndrome de Silver-Russell .
Doença infecciosa
O diagnóstico molecular é usado para identificar doenças infecciosas, como clamídia , vírus da gripe e tuberculose ; ou cepas específicas, como vírus H1N1 ou SARS-CoV-2 . A identificação genética pode ser rápida; por exemplo, um teste de amplificação isotérmica mediado por loop diagnostica o parasita da malária e é robusto o suficiente para países em desenvolvimento. Mas, apesar desses avanços na análise do genoma, em 2013 as infecções ainda são mais frequentemente identificadas por outros meios - seu proteoma, bacteriófago ou perfil cromatográfico . O diagnóstico molecular também é usado para entender a cepa específica do patógeno - por exemplo, detectando quais genes de resistência a drogas ele possui - e, portanto, quais terapias devem ser evitadas. Além disso, ensaios baseados em sequenciamento metagenômico de próxima geração podem ser implementados para identificar organismos patogênicos sem viés.
Gestão de risco de doenças
O genoma de um paciente pode incluir uma mutação hereditária ou aleatória que afeta a probabilidade de desenvolver uma doença no futuro. Por exemplo, a síndrome de Lynch é uma doença genética que predispõe os pacientes a câncer colorretal e outros tipos de câncer; a detecção precoce pode levar a um monitoramento rigoroso que aumenta as chances de o paciente ter um bom resultado. O risco cardiovascular é indicado por marcadores biológicos e a triagem pode medir o risco de uma criança nascer com uma doença genética, como a fibrose cística . O teste genético é eticamente complexo: os pacientes podem não querer o estresse de saber seu risco. Em países sem saúde universal, um risco conhecido pode aumentar os prêmios de seguro.
Câncer
O câncer é uma mudança nos processos celulares que faz com que um tumor cresça fora de controle. As células cancerosas às vezes apresentam mutações em oncogenes , como KRAS e CTNNB1 (β-catenina). Analisar a assinatura molecular das células cancerosas - o DNA e seus níveis de expressão via RNA mensageiro - permite aos médicos caracterizar o câncer e escolher a melhor terapia para seus pacientes. A partir de 2010, os ensaios que incorporam uma série de anticorpos contra moléculas marcadoras de proteínas específicas são uma tecnologia emergente; há esperanças para esses ensaios multiplex que podem medir muitos marcadores de uma vez. Outros potenciais biomarcadores futuros incluem micro moléculas de RNA , que as células cancerosas expressam mais do que as saudáveis.
O câncer é uma doença com causas moleculares excessivas e evolução constante. Também há heterogeneidade da doença, mesmo em um indivíduo. Estudos moleculares do câncer provaram a importância das mutações condutoras no crescimento e metástase de tumores. Muitas tecnologias para detecção de variações de sequência foram desenvolvidas para a pesquisa do câncer. Essas tecnologias geralmente podem ser agrupadas em três abordagens: reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridização e sequenciamento de próxima geração (NGS). Atualmente, muitos ensaios de PCR e hibridização foram aprovados pelo FDA como diagnóstico in vitro. Os ensaios NGS, no entanto, ainda estão em um estágio inicial no diagnóstico clínico.
Para fazer o teste de diagnóstico molecular do câncer, uma das questões importantes é a detecção da variação da sequência de DNA. As amostras de biópsia de tumor usadas para diagnóstico sempre contêm tão pouco quanto 5% da variante alvo em comparação com a sequência do tipo selvagem. Além disso, para aplicações não invasivas de sangue periférico ou urina, o teste de DNA deve ser específico o suficiente para detectar mutações em frequências de alelos variantes inferiores a 0,1%.
Atualmente, ao otimizar o PCR tradicional, há uma nova invenção, o sistema de mutação refratária à amplificação (ARMS) é um método para detectar variantes de sequência de DNA no câncer. O princípio por trás do ARMS é que a atividade de extensão enzimática das DNA polimerases é altamente sensível a incompatibilidades perto da extremidade 3 'do primer. Muitas empresas diferentes desenvolveram testes de diagnóstico com base nos primers ARMS PCR. Por exemplo, Qiagen therascreen, Roche cobas e Biomerieux THxID desenvolveram testes de PCR aprovados pela FDA para detectar mutações de pulmão, câncer de cólon e melanoma metastático nos genes KRAS, EGFR e BRAF. Seus kits de IVD foram basicamente validados em DNA genômico extraído de tecido FFPE.
Existem também microarrays que utilizam o mecanismo de hibridização para fazer diagnósticos de câncer. Mais de um milhão de sondas diferentes podem ser sintetizadas em uma matriz com a tecnologia Genechip da Affymetrix com um limite de detecção de uma a dez cópias de mRNA por poço. Microarrays otimizados são normalmente considerados para produzir quantificação relativa repetível de diferentes alvos. Atualmente, o FDA já aprovou uma série de ensaios de diagnóstico utilizando microarranjos: os ensaios MammaPrint da Agendia podem informar o risco de recorrência do câncer de mama traçando o perfil da expressão de 70 genes relacionados ao câncer de mama; O ensaio autogenômico INFNITI CYP2C19 pode traçar o perfil de polimorfismos genéticos, cujos impactos na resposta terapêutica aos antidepressivos são grandes; e o CytoScan Dx da Affymetrix pode avaliar deficiências intelectuais e distúrbios congênitos por meio da análise de mutações cromossômicas.
No futuro, as ferramentas de diagnóstico de câncer provavelmente se concentrarão no Sequenciamento de Próxima Geração (NGS). Ao utilizar o sequenciamento de DNA e RNA para fazer diagnósticos de câncer, a tecnologia no campo das ferramentas de diagnóstico molecular se desenvolverá melhor. Embora a taxa de transferência e o preço do NGS tenham sido reduzidos drasticamente nos últimos 10 anos em cerca de 100 vezes, continuamos a pelo menos 6 ordens de magnitude de realizar o sequenciamento profundo em um nível de genoma completo. Atualmente, a Ion Torrent desenvolveu alguns painéis NGS com base no AmpliSeq translacional, por exemplo, o Oncomine Comprehensive Assay. Eles estão se concentrando na utilização de sequenciamento profundo de genes relacionados ao câncer para detectar variantes de sequências raras.
A ferramenta de diagnóstico molecular pode ser usada para avaliação de risco de câncer. Por exemplo, o teste BRCA1 / 2 da Myriad Genetics avalia as mulheres quanto ao risco de câncer de mama ao longo da vida. Além disso, alguns tipos de câncer nem sempre são empregados com sintomas claros. É útil analisar as pessoas quando elas não apresentam sintomas óbvios e, portanto, podem detectar o câncer nos estágios iniciais. Por exemplo, o teste ColoGuard pode ser usado para triagem de câncer colorretal em pessoas com mais de 55 anos . O câncer é uma doença de longa escala com várias etapas de progressão, ferramentas de diagnóstico molecular podem ser usadas para o prognóstico da progressão do câncer. Por exemplo, o teste OncoType Dx da Genomic Health pode estimar o risco de câncer de mama. Sua tecnologia pode informar os pacientes a buscarem quimioterapia quando necessário, examinando os níveis de expressão de RNA no tecido de biópsia do câncer de mama.
Com o aumento do apoio governamental no diagnóstico molecular de DNA, espera-se que um número crescente de ensaios clínicos de detecção de DNA para cânceres esteja disponível em breve. Atualmente, as pesquisas em diagnósticos de câncer estão se desenvolvendo rapidamente com metas de menor custo, menor consumo de tempo e métodos mais simples para médicos e pacientes.
Veja também
- Medicina molecular (o campo mais amplo da compreensão molecular da doença)
- Patologia molecular
- Teste Desenvolvido em Laboratório
- Patogênese
- Patogenômica
- Patologia
- Medicina de precisão
- Remédio personalizado