Oligonucleotídeo - Oligonucleotide

Os oligonucleotídeos são moléculas curtas de DNA ou RNA , oligômeros , que têm uma ampla gama de aplicações em testes genéticos , pesquisa e perícia . Normalmente feitos em laboratório por síntese química em fase sólida , esses pequenos pedaços de ácidos nucleicos podem ser fabricados como moléculas de fita simples com qualquer sequência especificada pelo usuário e, portanto, são vitais para a síntese de genes artificiais , reação em cadeia da polimerase (PCR), DNA sequenciação , clonagem molecular e como sondas moleculares . Na natureza, os oligonucleotídeos são geralmente encontrados como pequenas moléculas de RNA que funcionam na regulação da expressão gênica (por exemplo, microRNA ), ou são intermediários de degradação derivados da quebra de moléculas maiores de ácido nucleico.

Os oligonucleotídeos são caracterizados pela sequência de resíduos de nucleotídeos que constituem a molécula inteira. O comprimento do oligonucleotídeo é geralmente denotado por " -mer " (do grego meros , "parte"). Por exemplo, um oligonucleotídeo de seis nucleotídeos (nt) é um hexâmero, enquanto um de 25 nt normalmente seria chamado de "25-mer". Os oligonucleotídeos se ligam prontamente, de uma maneira específica para a sequência, aos seus respectivos oligonucleotídeos complementares , DNA ou RNA para formar duplexes ou, com menos frequência, híbridos de ordem superior. Esta propriedade básica serve como base para o uso de oligonucleotídeos como sondas para a detecção de sequências específicas de DNA ou RNA. Exemplos de procedimentos que usam oligonucleotídeos incluem microarrays de DNA , Southern blots , análise de ASO , hibridização fluorescente in situ (FISH), PCR e a síntese de genes artificiais.

Os oligonucleotídeos são compostos por 2'-desoxirribonucleotídeos (oligodesoxirribonucleotídeos), que podem ser modificados na estrutura ou na posição 2 'do açúcar para atingir diferentes efeitos farmacológicos. Essas modificações fornecem novas propriedades aos oligonucleotídeos e os tornam um elemento-chave na terapia antisense .

Síntese

Os oligonucleotídeos são sintetizados quimicamente usando blocos de construção, fosforamiditos protegidos de nucleosídeos naturais ou quimicamente modificados ou, em menor extensão, de compostos não nucleosídicos. A montagem da cadeia de oligonucleotídeo prossegue na direção 3 'para 5' seguindo um procedimento de rotina denominado "ciclo sintético". A conclusão de um único ciclo sintético resulta na adição de um resíduo de nucleotídeo à cadeia em crescimento. Um rendimento inferior a 100% de cada etapa de síntese e a ocorrência de reações colaterais estabelecem limites práticos da eficiência do processo. Em geral, as sequências de oligonucleotídeos são geralmente curtas (13-25 nucleotídeos de comprimento). O comprimento máximo dos oligonucleotídeos sintéticos dificilmente excede 200 resíduos de nucleotídeos. HPLC e outros métodos podem ser usados ​​para isolar produtos com a sequência desejada.

Modificações químicas

A criação de oligonucleotídeos curtos quimicamente estáveis ​​foi o primeiro desafio no desenvolvimento de terapias ASO. Os oligonucleotídeos de ocorrência natural são facilmente degradados pelas nucleases, uma enzima que cliva os nucleotídeos e é ampla em todos os tipos de células. As sequências oligonucleotídicas curtas também têm afinidades de ligação intrínseca fracas, o que contribui para a sua degradação in vivo.

Modificações de backbone

Os análogos de organotiofosfato de nucleosídeo (PS) de nucleotídeos fornecem aos oligonucleotídeos algumas propriedades benéficas. As principais propriedades benéficas que os esqueletos de PS fornecem aos nucleotídeos são a identificação de diastereômeros de cada nucleotídeo e a capacidade de seguir facilmente as reações envolvendo os nucleotídeos fosforotioato, o que é útil na síntese de oligonucleotídeos. As modificações do esqueleto de PS em oligonucleotídeos os protegem contra a degradação indesejada por enzimas. A modificação da estrutura do nucleotídeo é amplamente utilizada porque pode ser alcançada com relativa facilidade e precisão na maioria dos nucleotídeos. Modificações fluorescentes nas extremidades 5 'e 3' dos oligonucleotídeos foram relatadas para avaliar as estruturas, dinâmica e interações dos oligonucleotídeos com respeito ao meio ambiente.

Modificações do anel de açúcar

Outra modificação que é útil para aplicações médicas de oligonucleotídeos são as modificações de açúcar 2 ' . A modificação da posição 2 'do açúcar aumenta a eficácia dos oligonucleotídeos ao aumentar as capacidades de ligação ao alvo dos oligonucleotídeos, especificamente em terapias de oligonucleotídeos antisense . Eles também diminuem a ligação não específica a proteínas, aumentando a precisão de direcionar proteínas específicas. Duas das modificações mais comumente usadas são 2'-O-metil e 2'-O-metoxietil. Modificações fluorescentes na nucleobase também foram relatadas.

Oligonucleotídeos antisense

Os oligonucleotídeos anti-sentido (ASO) são fitas simples de DNA ou RNA que são complementares a uma sequência escolhida. No caso do RNA antisense, eles evitam a tradução da proteína de certas fitas de RNA mensageiro ligando-se a elas, em um processo denominado hibridização . Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser usados ​​para direcionar um RNA específico complementar (codificante ou não ). Se esta ligação ocorre híbrido pode ser degradado pela enzima RNase H . A RNase H é uma enzima que hidrolisa o RNA e, quando usada em uma aplicação de oligonucleotídeo antisense, resulta em 80-95% de regulação negativa da expressão de mRNA.

O uso de oligonucleotídeos antisense Morpholino para knockdowns de genes em vertebrados , que agora é uma técnica padrão na biologia do desenvolvimento e é usada para estudar a expressão e a função gênicas alteradas , foi desenvolvido pela primeira vez por Janet Heasman usando o Xenopus . Os medicamentos Morpholino aprovados pela FDA incluem eteplirsen e golodirsen . Os oligonucleotídeos antisense também foram usados ​​para inibir a replicação do vírus influenza em linhas celulares.

As doenças neurodegenerativas resultantes de uma única proteína mutante são bons alvos para terapias de oligonucleotídeos antisense devido à sua capacidade de direcionar e modificar sequências muito específicas de RNA com alta seletividade. Muitas doenças genéticas, incluindo doença de Huntington , doença de Alzheimer , doença de Parkinson e esclerose lateral amiotrófica (ALS), foram associadas a alterações de DNA que resultam em sequências de RNA incorretas e resultam em proteínas mal traduzidas que têm um efeito fisiológico tóxico.

Técnicas analíticas

Cromatografia

As alquilamidas podem ser usadas como fases estacionárias cromatográficas . Essas fases foram investigadas para a separação de oligonucleotídeos. A cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa de par de íons é usada para separar e analisar os oligonucleotídeos após a síntese automatizada.

Espectrometria de massa

Uma mistura de ácido 5-metoxissalicílico e espermina pode ser usada como uma matriz para análise de oligonucleotídeos em espectrometria de massa MALDI . A Espectometria de Massa por Ionização por ElectroSpray (ESI-MS) também é uma ferramenta poderosa para caracterizar a massa de oligonucleotídeos.

Microarray de DNA

Os microarranjos de DNA são uma aplicação analítica útil de oligonucleotídeos. Em comparação com os microarranjos de cDNA padrão , os microarranjos baseados em oligonucleotídeos têm especificidade mais controlada em relação à hibridização e a capacidade de medir a presença e prevalência de sequências em splicing alternativo ou poliadeniladas . Um subtipo de microarranjos de DNA pode ser descrito como substrato (náilon, vidro, etc.) aos quais os oligonucleotídeos foram ligados em alta densidade. Existem várias aplicações de microarranjos de DNA nas ciências biológicas.

Veja também

• Aptâmeros , oligonucleotídeos com importantes aplicações biológicas
• Morfolinos , oligos com estruturas não naturais, que não ativam RNase-H, mas podem reduzir a expressão gênica ou modificar o splicing de RNA
• Polimorfismo , o aparecimento em uma população do mesmo gene em várias formas devido a mutações; muitas vezes pode ser testado com sondas ASO
• Oligodeoxinucleotídeo CpG , um ODN com propriedades imunoestimulatórias
• Grampos de cabelo de Hoogsteen reverso de polipurina, PPRHs, oligonucleotídeos que podem se ligar a DNA ou RNA e diminuir a expressão gênica.

Referências

Leitura adicional

links externos

• RNAi Atlas : um banco de dados de bibliotecas RNAi e seus resultados de análise de destino
• physorg.com | Fonte genética de distrofia muscular neutralizada