Microscópio óptico - Optical microscope

Um microscópio óptico moderno com uma lâmpada de mercúrio para microscopia de fluorescência . O microscópio possui uma câmera digital que é conectada a um computador .

O microscópio óptico , também conhecido como microscópio de luz , é um tipo de microscópio que comumente usa luz visível e um sistema de lentes para gerar imagens ampliadas de pequenos objetos. Os microscópios ópticos são o design mais antigo de microscópio e foram possivelmente inventados em sua forma composta atual no século XVII. Os microscópios ópticos básicos podem ser muito simples, embora muitos projetos complexos visem melhorar a resolução e o contraste da amostra .

O objeto é colocado em um palco e pode ser visto diretamente através de uma ou duas oculares do microscópio. Em microscópios de alta potência, ambas as oculares normalmente mostram a mesma imagem, mas com um microscópio estereoscópico , imagens ligeiramente diferentes são usadas para criar um efeito 3-D. Normalmente, uma câmera é usada para capturar a imagem ( micrografia ).

A amostra pode ser iluminada de várias maneiras. Objetos transparentes podem ser iluminados por baixo e objetos sólidos podem ser iluminados com luz passando ( campo claro ) ou ao redor ( campo escuro ) da lente objetiva. A luz polarizada pode ser usada para determinar a orientação do cristal de objetos metálicos. A imagem de contraste de fase pode ser usada para aumentar o contraste da imagem, destacando pequenos detalhes de diferentes índices de refração.

Uma variedade de lentes objetivas com diferentes ampliações são normalmente fornecidas montadas em uma torre, permitindo que sejam giradas no lugar e proporcionando a capacidade de aumentar o zoom. O poder de ampliação máximo dos microscópios ópticos é normalmente limitado a cerca de 1000x devido ao poder de resolução limitado da luz visível. A ampliação de um microscópio óptico composto é o produto da ampliação da ocular (digamos 10x) e da lente objetiva (digamos 100x), para dar uma ampliação total de 1.000x. Ambientes modificados, como o uso de óleo ou luz ultravioleta, podem aumentar a ampliação.

Alternativas para microscopia óptica que não usam luz visível incluem microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de sonda de varredura e, como resultado, podem atingir ampliações muito maiores.

Tipos

Diagrama de um microscópio simples

Existem dois tipos básicos de microscópios ópticos: microscópios simples e microscópios compostos. Um microscópio simples usa o poder óptico de uma única lente ou grupo de lentes para ampliação. Um microscópio composto usa um sistema de lentes (um conjunto ampliando a imagem produzida por outro) para obter uma ampliação muito maior de um objeto. A grande maioria dos microscópios de pesquisa modernos são microscópios compostos, enquanto alguns microscópios digitais comerciais mais baratos são microscópios de lente única simples. Os microscópios compostos podem ser divididos em uma variedade de outros tipos de microscópios que diferem em suas configurações ópticas, custo e finalidades pretendidas.

Microscópio simples

Um microscópio simples usa uma lente ou conjunto de lentes para ampliar um objeto apenas através da ampliação angular, dando ao observador uma imagem virtual ampliada ereta . O uso de uma única lente convexa ou grupos de lentes é encontrado em dispositivos de ampliação simples, como lupas , lupas e oculares para telescópios e microscópios.

Microscópio composto

Diagrama de um microscópio composto

Um microscópio composto usa uma lente próxima ao objeto que está sendo visto para coletar luz (chamada de lente objetiva ) que focaliza uma imagem real do objeto dentro do microscópio (imagem 1). Essa imagem é então ampliada por uma segunda lente ou grupo de lentes (chamada de ocular ) que dá ao observador uma imagem virtual invertida ampliada do objeto (imagem 2). O uso de uma combinação de objetiva / ocular permite uma ampliação muito maior. Microscópios compostos comuns geralmente apresentam lentes objetivas intercambiáveis, permitindo ao usuário ajustar rapidamente a ampliação. Um microscópio composto também permite configurações de iluminação mais avançadas, como contraste de fase .

Outras variantes do microscópio

Existem muitas variantes do design do microscópio óptico composto para fins especializados. Algumas delas são diferenças de design físico que permitem a especialização para determinados fins:

Outras variantes do microscópio são projetadas para diferentes técnicas de iluminação:

  • Microscópio petrográfico , cujo design geralmente inclui um filtro polarizador, estágio rotativo e placa de gesso para facilitar o estudo de minerais ou outros materiais cristalinos cujas propriedades ópticas podem variar com a orientação.
  • Microscópio polarizador , semelhante ao microscópio petrográfico.
  • Microscópio com contraste de fase , que aplica o método de iluminação com contraste de fase.
  • Microscópio de epifluorescência , projetado para análise de amostras que incluem fluoróforos.
  • Microscópio confocal , uma variante amplamente usada de iluminação epifluorescente que usa um laser de varredura para iluminar uma amostra para fluorescência.
  • Microscópio de dois fótons , usado para obter imagens de fluorescência mais profundas em meios de espalhamento e reduzir o fotodegradação, especialmente em amostras vivas.
  • Microscópio do aluno - geralmente um microscópio de baixa potência com controles simplificados e, às vezes, óptica de baixa qualidade, projetado para uso escolar ou como um instrumento inicial para crianças.
  • Ultramicroscópio , um microscópio de luz adaptado que usa espalhamento de luz para permitir a visualização de partículas minúsculas cujo diâmetro está abaixo ou próximo do comprimento de onda da luz visível (cerca de 500 nanômetros); principalmente obsoleto desde o advento dos microscópios eletrônicos
  • O microscópio Raman com ponta aprimorada é uma variante do microscópio óptico com base na espectroscopia Raman com ponta , sem limites de resolução baseados em comprimento de onda tradicional. Este microscópio realizado principalmente nas plataformas de microscópio de sonda de varredura usando todas as ferramentas ópticas.

Microscópio digital

Um microscópio USB em miniatura .

Um microscópio digital é um microscópio equipado com uma câmera digital que permite a observação de uma amostra por meio de um computador . Os microscópios também podem ser parcial ou totalmente controlados por computador com vários níveis de automação. A microscopia digital permite uma maior análise da imagem de um microscópio, por exemplo, medidas de distâncias e áreas e quantificação de uma mancha fluorescente ou histológica .

Microscópios digitais de baixa potência, microscópios USB , também estão disponíveis comercialmente. Estas são essencialmente webcams com lentes macro de alta potência e geralmente não usam transiluminação . A câmera é conectada diretamente à porta USB de um computador para que as imagens sejam mostradas diretamente no monitor. Eles oferecem ampliações modestas (até cerca de 200 ×) sem a necessidade de usar oculares e com custo muito baixo. A iluminação de alta potência geralmente é fornecida por uma fonte de LED ou fontes adjacentes à lente da câmera.

Microscopia digital com níveis de luz muito baixos para evitar danos a amostras biológicas vulneráveis ​​está disponível usando câmeras digitais de contagem de fótons sensíveis . Foi demonstrado que uma fonte de luz fornecendo pares de fótons emaranhados pode minimizar o risco de danos às amostras mais sensíveis à luz. Nesta aplicação de imagem fantasma para microscopia de fótons esparsos, a amostra é iluminada com fótons infravermelhos, cada um dos quais é espacialmente correlacionado com um parceiro emaranhado na banda visível para imagens eficientes por uma câmera de contagem de fótons.

História

Invenção

Os primeiros microscópios eram lentes de aumento de lente única com ampliação limitada, que datam pelo menos desde o uso generalizado de lentes em óculos no século XIII.

Os microscópios compostos apareceram pela primeira vez na Europa por volta de 1620, incluindo um demonstrado por Cornelis Drebbel em Londres (por volta de 1621) e um exibido em Roma em 1624.

O verdadeiro inventor do microscópio composto é desconhecido, embora muitas afirmações tenham sido feitas ao longo dos anos. Isso inclui uma afirmação 35 anos depois de terem aparecido pelo fabricante de óculos holandês Johannes Zachariassen de que seu pai, Zacharias Janssen , inventou o microscópio composto e / ou o telescópio já em 1590. O testemunho de Johannes (alguns afirmam duvidoso) adia a data de invenção, portanto há muito tempo que Zacarias teria sido uma criança na época, levando à especulação de que, para a afirmação de Johannes ser verdade, o microscópio composto teria de ter sido inventado pelo avô de Johannes, Hans Martens. Outra alegação é que o concorrente de Janssen, Hans Lippershey (que solicitou a patente do primeiro telescópio em 1608), também inventou o microscópio composto. Outros historiadores apontam para o inovador holandês Cornelis Drebbel com seu microscópio composto de 1621.

Galileo Galilei às vezes também é citado como o inventor do microscópio composto. Depois de 1610, ele descobriu que podia focar seu telescópio para ver pequenos objetos, como moscas, de perto e / ou olhar pelo lado errado ao contrário para ampliar pequenos objetos. A única desvantagem era que seu telescópio de 2 pés de comprimento teve que ser estendido para 6 pés para ver objetos que se fecham. Depois de ver o microscópio composto construído por Drebbel exibido em Roma em 1624, Galileu construiu sua própria versão melhorada. Em 1625, Giovanni Faber criou o nome microscópio para o microscópio composto Galileo submetido à Accademia dei Lincei em 1624 (Galileo tinha chamado o " occhiolino " ou " pequeno olho "). Faber cunhou o nome das palavras gregas μικρόν (micron) que significa "pequeno", e σκοπεῖν (skopein) que significa "olhar para", um nome que deve ser análogo a " telescópio ", outra palavra cunhada pelos Linceanos.

Christiaan Huygens , outro holandês, desenvolveu um sistema ocular simples de 2 lentes no final do século 17 que foi corrigido acromaticamente e, portanto, um grande passo à frente no desenvolvimento do microscópio. A ocular Huygens ainda está sendo produzida até hoje, mas sofre de um pequeno tamanho de campo e outras desvantagens menores.

Popularização

A imagem publicada mais antiga conhecida por ter sido feita com um microscópio: abelhas por Francesco Stelluti , 1630

Antonie van Leeuwenhoek (1632–1724) tem o crédito de chamar a atenção dos biólogos para o microscópio, embora lentes de aumento simples já estivessem sendo produzidas no século XVI. Os microscópios caseiros de Van Leeuwenhoek eram microscópios simples, com uma única lente muito pequena, mas forte. Eles eram difíceis de usar, mas permitiam que van Leeuwenhoek visse imagens detalhadas. Demorou cerca de 150 anos de desenvolvimento óptico antes que o microscópio composto fosse capaz de fornecer a mesma qualidade de imagem que os microscópios simples de van Leeuwenhoek, devido às dificuldades na configuração de lentes múltiplas. Na década de 1850, John Leonard Riddell , professor de química na Universidade de Tulane , inventou o primeiro microscópio binocular prático enquanto realizava uma das primeiras e mais extensas investigações microscópicas americanas da cólera .

Técnicas de iluminação

Embora a tecnologia e a óptica de microscópio básicas estejam disponíveis há mais de 400 anos, é muito mais recente que as técnicas de iluminação de amostras foram desenvolvidas para gerar as imagens de alta qualidade vistas hoje.

Em agosto de 1893, August Köhler desenvolveu a iluminação Köhler . Este método de iluminação de amostra dá origem a uma iluminação extremamente uniforme e supera muitas limitações das técnicas mais antigas de iluminação de amostra. Antes do desenvolvimento da iluminação Köhler, a imagem da fonte de luz, por exemplo, um filamento de lâmpada , era sempre visível na imagem da amostra.

O Prêmio Nobel de Física foi concedido ao físico holandês Frits Zernike em 1953 por seu desenvolvimento de iluminação de contraste de fase, que permite imagens de amostras transparentes. Usando interferência em vez de absorção de luz, amostras extremamente transparentes, como células vivas de mamíferos , podem ser visualizadas sem ter que usar técnicas de coloração. Apenas dois anos depois, em 1955, Georges Nomarski publicou a teoria da microscopia de contraste por interferência diferencial , outra técnica de imagem baseada em interferência .

Microscópio Fluorescente

A microscopia biológica moderna depende muito do desenvolvimento de sondas fluorescentes para estruturas específicas dentro de uma célula. Em contraste com a microscopia de luz transiluminada normal, na microscopia de fluorescência a amostra é iluminada através da lente objetiva com um conjunto estreito de comprimentos de onda de luz. Esta luz interage com os fluoróforos na amostra, que então emitem luz com um comprimento de onda mais longo . É essa luz emitida que compõe a imagem.

Desde meados do século 20, as manchas fluorescentes químicas, como DAPI que se liga ao DNA , têm sido usadas para marcar estruturas específicas dentro da célula. Desenvolvimentos mais recentes incluem imunofluorescência , que usa anticorpos marcados com fluorescência para reconhecer proteínas específicas dentro de uma amostra, e proteínas fluorescentes como GFP que uma célula viva pode expressar tornando-a fluorescente.

Componentes

Elementos básicos do microscópio óptico de transmissão (década de 1990)

Todos os microscópios ópticos modernos projetados para visualizar amostras por luz transmitida compartilham os mesmos componentes básicos do caminho da luz. Além disso, a grande maioria dos microscópios tem os mesmos componentes 'estruturais' (numerados abaixo de acordo com a imagem à direita):

  • Ocular (lente ocular) (1)
  • Torre da objetiva, revólver ou peça de nariz giratória (para segurar várias lentes objetivas) (2)
  • Lentes objetivas (3)
  • Botões de foco (para mover o palco)
    • Ajuste grosso (4)
    • Ajuste fino (5)
  • Estágio (para segurar a amostra) (6)
  • Fonte de luz (uma luz ou um espelho ) (7)
  • Diafragma e condensador (8)
  • Estágio mecânico (9)

Ocular (lente ocular)

A ocular , ou lente ocular, é um cilindro contendo duas ou mais lentes; sua função é trazer a imagem em foco para o olho. A ocular é inserida na extremidade superior do tubo do corpo. As oculares são intercambiáveis ​​e muitas oculares diferentes podem ser inseridas com diferentes graus de ampliação. Os valores de ampliação típicos para oculares incluem 5 ×, 10 × (o mais comum), 15 × e 20 ×. Em alguns microscópios de alto desempenho, a configuração óptica da lente objetiva e da ocular são combinadas para fornecer o melhor desempenho óptico possível. Isso ocorre mais comumente com objetivos apocromáticos .

Torre da objetiva (revólver ou bico giratório)

Torreta objetiva, revólver ou bico giratório é a parte que segura o conjunto de lentes objetivas. Ele permite que o usuário alterne entre as lentes objetivas.

Lentes objetivas

Na extremidade inferior de um microscópio óptico composto típico, há uma ou mais lentes objetivas que coletam luz da amostra. A objetiva está geralmente em um invólucro cilíndrico contendo uma lente composta de um ou vários elementos de vidro. Normalmente, haverá cerca de três lentes objetivas aparafusadas em um bico circular que pode ser girado para selecionar a lente objetiva necessária. Esses arranjos são projetados para serem parfocais , o que significa que quando uma muda de uma lente para outra em um microscópio, a amostra permanece em foco . As objetivas do microscópio são caracterizadas por dois parâmetros, a saber, ampliação e abertura numérica . O primeiro varia tipicamente de 5 × a 100 ×, enquanto o último varia de 0,14 a 0,7, correspondendo a distâncias focais de cerca de 40 a 2 mm, respectivamente. As lentes objetivas com ampliações mais altas normalmente têm uma abertura numérica mais alta e uma profundidade de campo mais curta na imagem resultante. Algumas lentes objetivas de alto desempenho podem exigir oculares correspondentes para oferecer o melhor desempenho óptico.

Objetivo de imersão em óleo

Duas lentes objetivas de microscópio de imersão em óleo Leica : 100 × (esquerda) e 40 × (direita)

Alguns microscópios usam objetivas de imersão em óleo ou objetivas de imersão em água para maior resolução em alta ampliação. Eles são usados ​​com material de correspondência de índice , como óleo de imersão ou água e uma lamínula combinada entre a lente objetiva e a amostra. O índice de refração do material de correspondência de índice é maior do que o ar, permitindo que a lente objetiva tenha uma abertura numérica maior (maior que 1), de modo que a luz seja transmitida da amostra para a face externa da lente objetiva com refração mínima. Aberturas numéricas de até 1,6 podem ser alcançadas. A maior abertura numérica permite a coleta de mais luz, tornando possível a observação detalhada de detalhes menores. Uma lente de imersão em óleo geralmente tem uma ampliação de 40 a 100 ×.

Botões de foco

Os botões de ajuste movem o palco para cima e para baixo com ajuste separado para foco grosso e fino. Os mesmos controles permitem que o microscópio se ajuste a amostras de diferentes espessuras. Em designs mais antigos de microscópios, as rodas de ajuste de foco movem o tubo do microscópio para cima ou para baixo em relação ao suporte e tinham um estágio fixo.

Quadro

Todo o conjunto óptico é tradicionalmente preso a um braço rígido, que por sua vez é preso a um robusto pé em forma de U para fornecer a rigidez necessária. O ângulo do braço pode ser ajustável para permitir o ajuste do ângulo de visão.

A estrutura fornece um ponto de montagem para vários controles de microscópio. Normalmente, isso incluirá controles de foco, normalmente uma grande roda serrilhada para ajustar o foco grosso, junto com uma roda serrilhada menor para controlar o foco preciso. Outros recursos podem ser controles da lâmpada e / ou controles para ajustar o condensador.

Estágio

O estágio é uma plataforma abaixo da lente objetiva que suporta o espécime sendo visualizado. No centro do palco há um orifício pelo qual a luz passa para iluminar o espécime. O palco geralmente possui braços para segurar as lâminas (placas de vidro retangulares com dimensões típicas de 25 × 75 mm, nas quais o corpo de prova é montado).

Em ampliações superiores a 100 ×, mover um slide manualmente não é prático. Um estágio mecânico, típico de microscópios de médio e alto preço, permite pequenos movimentos da lâmina por meio de botões de controle que reposicionam a amostra / lâmina conforme desejado. Se um microscópio não tinha originalmente um estágio mecânico, pode ser possível adicionar um.

Todos os estágios se movem para cima e para baixo para foco. Com um estágio mecânico, as lâminas movem-se em dois eixos horizontais para posicionar a amostra e examinar seus detalhes.

O foco começa com uma ampliação menor para centralizar a amostra pelo usuário no palco. Mover para uma ampliação maior requer que o estágio seja movido verticalmente para um novo foco na ampliação maior e também pode requerer um leve ajuste da posição horizontal da amostra. Os ajustes de posição horizontal da amostra são a razão de ter um estágio mecânico.

Devido à dificuldade em preparar as amostras e montá-las em slides, para crianças é melhor começar com slides preparados que são centralizados e focalizam facilmente, independentemente do nível de foco usado.

Fonte de luz

Muitas fontes de luz podem ser usadas. Em sua forma mais simples, a luz do dia é direcionada por meio de um espelho . A maioria dos microscópios, no entanto, tem sua própria fonte de luz ajustável e controlável - geralmente uma lâmpada halógena , embora a iluminação por LEDs e lasers esteja se tornando uma disposição mais comum. A iluminação Köhler é freqüentemente fornecida em instrumentos mais caros.

Condensador

O condensador é uma lente projetada para focar a luz da fonte de iluminação na amostra. O condensador também pode incluir outros recursos, como um diafragma e / ou filtros, para gerenciar a qualidade e a intensidade da iluminação. Para técnicas de iluminação como campo escuro , contraste de fase e microscopia de contraste de interferência diferencial, componentes ópticos adicionais devem ser precisamente alinhados no caminho da luz.

Ampliação

O poder real ou ampliação de um microscópio óptico composto é o produto dos poderes da ocular ( ocular ) e da lente objetiva. As ampliações normais máximas da ocular e da objetiva são 10 × e 100 × respectivamente, dando uma ampliação final de 1.000 ×.

Ampliação e micrografias

Ao usar uma câmera para capturar uma micrografia, a ampliação efetiva da imagem deve levar em consideração o tamanho da imagem. Isso independe de ser uma impressão de um negativo de filme ou exibido digitalmente na tela do computador .

No caso de câmeras de filme fotográfico, o cálculo é simples; a ampliação final é o produto: da ampliação da lente objetiva, da ampliação da óptica da câmera e do fator de ampliação da impressão do filme em relação ao negativo. Um valor típico do fator de ampliação é de cerca de 5 × (para o caso de um filme de 35 mm e uma impressão de 15 × 10 cm (6 × 4 polegadas)).

No caso de câmeras digitais, o tamanho dos pixels no detector CMOS ou CCD e o tamanho dos pixels na tela devem ser conhecidos. O fator de ampliação do detector para os pixels na tela pode então ser calculado. Tal como acontece com uma câmera de filme, a ampliação final é o produto: da ampliação da lente objetiva, da ampliação da ótica da câmera e do fator de ampliação.

Operação

Técnicas de iluminação

Estão disponíveis muitas técnicas que modificam o caminho da luz para gerar uma imagem de contraste aprimorada de uma amostra. As principais técnicas para gerar maior contraste da amostra incluem luz com polarização cruzada , campo escuro , contraste de fase e iluminação de contraste de interferência diferencial . Uma técnica recente ( Sarfus ) combina luz polarizada cruzada e slides específicos com contraste para a visualização de amostras nanométricas.

Outras técnicas

Os microscópios modernos permitem mais do que apenas a observação da imagem de luz transmitida de uma amostra; existem muitas técnicas que podem ser usadas para extrair outros tipos de dados. A maioria deles requer equipamento adicional além de um microscópio composto básico.

  • Luz refletida, ou iluminação incidente (para análise de estruturas de superfície)
  • Microscopia de fluorescência, ambos:
  • Microspectroscopia (onde um espectrofotômetro UV-visível é integrado a um microscópio óptico)
  • Microscopia ultravioleta
  • Microscopia de infravermelho próximo
  • Microscopia de transmissão múltipla para aumento de contraste e redução de aberração.
  • Automação (para digitalização automática de uma grande amostra ou captura de imagem)

Formulários

Uma imagem com ampliação de 40x das células em um exame médico de esfregaço feito através de um microscópio óptico usando uma técnica de montagem úmida , colocando a amostra em uma lâmina de vidro e misturando com uma solução de sal

A microscopia óptica é amplamente utilizada em microeletrônica, nanofísica, biotecnologia, pesquisa farmacêutica, mineralogia e microbiologia.

A microscopia óptica é usada para diagnóstico médico , o campo sendo denominado histopatologia quando se trata de tecidos ou em testes de esfregaço em células livres ou fragmentos de tecido.

No uso industrial, os microscópios binoculares são comuns. Além de aplicações que precisam de percepção de profundidade real , o uso de oculares duplas reduz o cansaço visual associado a longos dias de trabalho em uma estação de microscopia. Em certas aplicações, microscópios de longa distância ou de foco longo são benéficos. Um item pode precisar ser examinado atrás de uma janela , ou objetos industriais podem ser um perigo para o objetivo. Essa ótica se assemelha a telescópios com recursos de foco próximo.

Microscópios de medição são usados ​​para medições de precisão. Existem dois tipos básicos. Um possui retículo graduado para permitir a medição de distâncias no plano focal. O outro (e mais antigo) tipo tem retículos simples e um mecanismo de micrômetro para mover o assunto em relação ao microscópio.

Microscópios portáteis muito pequenos encontraram alguma utilidade em lugares onde um microscópio de laboratório seria um fardo.

Limitações

O limite de difração gravado em pedra em um monumento para Ernst Abbe .

Em ampliações muito altas com luz transmitida, os objetos pontuais são vistos como discos difusos cercados por anéis de difração . Eles são chamados de discos Airy . O poder de resolução de um microscópio é considerado a capacidade de distinguir entre dois discos de Airy próximos (ou, em outras palavras, a capacidade do microscópio de revelar detalhes estruturais adjacentes como distintos e separados). São esses impactos da difração que limitam a capacidade de resolver pequenos detalhes. A extensão e magnitude dos padrões de difração são afetados pelo comprimento de onda da luz (λ), os materiais refrativos usados ​​para fabricar a lente objetiva e a abertura numérica (NA) da lente objetiva. Existe, portanto, um limite finito além do qual é impossível resolver pontos separados no campo objetivo, conhecido como limite de difração . Assumindo que as aberrações ópticas em toda a configuração óptica são insignificantes, a resolução d pode ser declarada como:

Normalmente, um comprimento de onda de 550 nm é assumido, o que corresponde à luz verde . Com o ar como meio externo, o NA prático mais alto é 0,95, e com óleo, até 1,5. Na prática, o valor mais baixo de d que pode ser obtido com lentes convencionais é de cerca de 200 nm. Um novo tipo de lente usando espalhamento múltiplo de luz permitiu melhorar a resolução abaixo de 100 nm.

Ultrapassando o limite de resolução

Várias técnicas estão disponíveis para atingir resoluções mais altas do que o limite de luz transmitida descrito acima. Técnicas holográficas, conforme descritas por Courjon e Bulabois em 1979, também são capazes de quebrar esse limite de resolução, embora a resolução tenha sido restrita em sua análise experimental.

Usando amostras fluorescentes, mais técnicas estão disponíveis. Os exemplos incluem o Vertico SMI , microscopia ótica de varredura de campo próximo que usa ondas evanescentes e depleção de emissão estimulada . Em 2005, um microscópio capaz de detectar uma única molécula foi descrito como uma ferramenta de ensino.

Apesar dos avanços significativos na última década, as técnicas para ultrapassar o limite de difração permanecem limitadas e especializadas.

Enquanto a maioria das técnicas se concentra em aumentos na resolução lateral, também existem algumas técnicas que visam permitir a análise de amostras extremamente finas. Por exemplo, os métodos Sarfus colocam a amostra fina em uma superfície de aumento de contraste e, assim, permitem visualizar diretamente filmes tão finos quanto 0,3 nanômetros.

Em 8 de outubro de 2014, o Prêmio Nobel de Química foi concedido a Eric Betzig , William Moerner e Stefan Hell pelo desenvolvimento da microscopia de fluorescência super-resolvida .

Iluminação estruturada SMI

SMI (microscopia de iluminação modulada espacialmente) é um processo óptico de luz da chamada engenharia de função de espalhamento de ponto (PSF). Estes são processos que modificam o PSF de um microscópio de uma maneira adequada para aumentar a resolução óptica, para maximizar a precisão das medições de distância de objetos fluorescentes que são pequenos em relação ao comprimento de onda da luz iluminante, ou para extrair outros parâmetros estruturais em a faixa nanométrica.

Microscopia de localização SPDMphymod

3D Dual Color Super Resolution Microscopy Cremer de 2010
Microscopia 3D de super resolução de cor dupla com Her2 e Her3 em células da mama, corantes padrão: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (microscopia de distância de precisão espectral), a tecnologia de microscopia de localização básica é um processo ótico de luz de microscopia de fluorescência que permite medições de posição, distância e ângulo em partículas "opticamente isoladas" (por exemplo, moléculas) bem abaixo do limite teórico de resolução para microscopia de luz. "Opticamente isolado" significa que em um determinado ponto no tempo, apenas uma única partícula / molécula dentro de uma região de um tamanho determinado por resolução óptica convencional (normalmente aproximadamente 200-250 nm de diâmetro ) está sendo registrada. Isso é possível quando as moléculas dentro de tal região carregam todos marcadores espectrais diferentes (por exemplo, cores diferentes ou outras diferenças utilizáveis ​​na emissão de luz de diferentes partículas).

Muitos corantes fluorescentes padrão como GFP , corantes Alexa, corantes Atto, Cy2 / Cy3 e moléculas de fluoresceína podem ser usados ​​para microscopia de localização, desde que certas condições fotofísicas estejam presentes. Usando essa tecnologia chamada SPDMphymod (fluoróforos fisicamente modificáveis), um único comprimento de onda de laser de intensidade adequada é suficiente para a nanoimagem.

Microscopia de super resolução 3D

A microscopia de super resolução 3D com corantes fluorescentes padrão pode ser obtida pela combinação de microscopia de localização para corantes fluorescentes padrão SPDMphymod e iluminação estruturada SMI.

STED

Imagem de microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) de filamentos de actina dentro de uma célula.

O esgotamento da emissão estimulada é um exemplo simples de como uma resolução mais alta ultrapassando o limite de difração é possível, mas tem grandes limitações. STED é uma técnica de microscopia de fluorescência que usa uma combinação de pulsos de luz para induzir fluorescência em uma pequena subpopulação de moléculas fluorescentes em uma amostra. Cada molécula produz um ponto de luz limitado por difração na imagem, e o centro de cada um desses pontos corresponde à localização da molécula. Como o número de moléculas fluorescentes é baixo, é improvável que os pontos de luz se sobreponham e, portanto, podem ser posicionados com precisão. Esse processo é então repetido várias vezes para gerar a imagem. Stefan Hell, do Instituto Max Planck de Química Biofísica, recebeu o 10º Prêmio Alemão do Futuro em 2006 e o ​​Prêmio Nobel de Química em 2014 por seu desenvolvimento do microscópio STED e metodologias associadas.

Alternativas

Para superar as limitações impostas pelo limite de difração da luz visível, foram projetados outros microscópios que utilizam outras ondas.

É importante notar que as ondas de frequência mais alta têm interação limitada com a matéria, por exemplo, os tecidos moles são relativamente transparentes aos raios X, resultando em fontes distintas de contraste e diferentes aplicações de alvo.

O uso de elétrons e raios-X no lugar da luz permite uma resolução muito maior - o comprimento de onda da radiação é menor, então o limite de difração é menor. Para tornar a sonda de comprimento de onda curto não destrutiva, o sistema de imagem por feixe atômico ( nanoscópio atômico ) foi proposto e amplamente discutido na literatura, mas ainda não é competitivo com os sistemas de imagem convencionais.

STM e AFM são técnicas de varredura de sonda usando uma pequena sonda que é varrida sobre a superfície da amostra. A resolução nesses casos é limitada pelo tamanho da sonda; As técnicas de microusinagem podem produzir sondas com raios de ponta de 5–10 nm.

Além disso, métodos como microscopia eletrônica ou de raios-X usam vácuo ou vácuo parcial, o que limita seu uso para amostras vivas e biológicas (com exceção de um microscópio eletrônico de varredura ambiental ). As câmaras de amostra necessárias para todos esses instrumentos também limitam o tamanho da amostra e a manipulação da amostra é mais difícil. A cor não pode ser vista em imagens feitas por esses métodos, portanto, algumas informações são perdidas. Eles são, no entanto, essenciais na investigação de efeitos moleculares ou atômicos, como o endurecimento por envelhecimento em ligas de alumínio ou a microestrutura de polímeros .

Veja também

Referências

Fontes citadas

  • Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). As origens do telescópio . Amsterdam University Press. ISBN 978-9069846156.

Leitura adicional

  • "Preparação de amostras metalográficas e materialográficas, microscopia de luz, análise de imagem e teste de dureza", Kay Geels em colaboração com Struers A / S, ASTM International 2006.
  • "Microscopia de luz: Uma revolução contemporânea em curso" , Siegfried Weisenburger e Vahid Sandoghdar, arXiv: 1412.3255 2014.

links externos