Extração de fenol-clorofórmio - Phenol–chloroform extraction
A extração de fenol-clorofórmio é uma técnica de extração líquido-líquido em biologia molecular usada para separar ácidos nucléicos de proteínas e lipídios .
Processar
Amostras aquosas, células lisadas ou tecido homogeneizado são misturados com volumes iguais de uma mistura de fenol : clorofórmio . Esta mistura é então centrifugada. Como a mistura fenol : clorofórmio é imiscível com água, a centrífuga fará com que duas fases distintas se formem: uma fase aquosa superior e uma fase orgânica inferior. A fase aquosa sobe para o topo porque é menos densa do que a fase orgânica contendo o fenol: clorofórmio. Essa diferença de densidade é a razão pela qual o fenol, que tem apenas uma densidade ligeiramente maior do que a água, deve ser misturado com clorofórmio para formar uma mistura com uma densidade muito maior do que a água.
Os lipídios hidrofóbicos irão se dividir na fase orgânica inferior e as proteínas permanecerão na interfase entre as duas fases, enquanto os ácidos nucleicos (bem como outros contaminantes, como sais, açúcares, etc.) permanecem na fase aquosa superior. A fase aquosa superior pode então ser removida com pipeta. Deve-se ter cuidado para evitar a pipetagem de qualquer fase ou material orgânico na interface . Este procedimento é frequentemente realizado várias vezes para aumentar a pureza do DNA. Este procedimento produz DNA de fita dupla grande que pode ser usado em PCR ou RFLP .
Se a mistura for ácida, o DNA precipitará na fase orgânica, enquanto o RNA permanecerá na fase aquosa. Isso ocorre porque o DNA é mais facilmente neutralizado do que o RNA.
Existem algumas desvantagens dessa técnica no uso forense. É demorado e usa reagentes perigosos. Além disso, por ser um processo de duas etapas que envolve a transferência de reagentes entre tubos, há um risco maior de contaminação .
Veja também
- Extração de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio
- Precipitação de etanol
- Purificação de ácido nucleico baseada em coluna de rotação
Referências
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