Piruvato quinase - Pyruvate kinase

Piruvato quinase
Domínios de proteína de piruvato quinase.png
Estrutura 3D da piruvato quinase ( 1PKN )
Identificadores
EC nº 2.7.1.40
CAS no. 9001-59-6
Bancos de dados
IntEnz Vista IntEnz
BRENDA Entrada BRENDA
ExPASy NiceZyme view
KEGG Entrada KEGG
MetaCyc via metabólica
PRIAM perfil
Estruturas PDB RCSB PDB PDBe PDBsum
Ontologia Genética AmiGO / QuickGO

A piruvato quinase é a enzima envolvida na última etapa da glicólise . Ela catalisa a transferência de um grupo fosfato a partir de fosfoenolpiruvato (PEP) para o difosfato de adenosina (ADP), dando origem a uma molécula de piruvato e uma molécula de ATP . A piruvato quinase foi nomeada de forma inadequada (inconsistentemente com uma quinase convencional ) antes de ser reconhecido que não catalisava diretamente a fosforilação do piruvato , o que não ocorre em condições fisiológicas. A piruvato quinase está presente em quatro isoenzimas distintas e específicas de tecidos em animais, cada uma consistindo em propriedades cinéticas específicas necessárias para acomodar as variações nos requisitos metabólicos de diversos tecidos.

Isozymes em vertebrados

Quatro isozimas de piruvato quinase expressas em vertebrados: L (fígado), R (eritrócitos), M1 (músculo e cérebro) e M2 (tecido fetal precoce e a maioria dos tecidos adultos). As isozimas L e R são expressas pelo gene PKLR , enquanto as isozimas M1 e M2 são expressas pelo gene PKM2 . As isozimas R e L diferem de M1 e M2 por serem reguladas alostericamente. Cineticamente, as isozimas R e L da piruvato quinase têm dois estados de conformação distintos; um com alta afinidade de substrato e outro com baixa afinidade de substrato. O estado R, caracterizado por alta afinidade ao substrato, atua como forma ativada da piruvato quinase e é estabilizado por PEP e frutose 1,6-bifosfato (FBP), promovendo a via glicolítica. O estado T, caracterizado pela baixa afinidade ao substrato, atua como a forma inativada da piruvato quinase, ligada e estabilizada por ATP e alanina , causando fosforilação da piruvato quinase e inibição da glicólise. A isozima M2 da piruvato quinase pode formar tetrâmeros ou dímeros. Os tetrâmeros têm alta afinidade para PEP, enquanto os dímeros têm baixa afinidade para PEP. A atividade enzimática pode ser regulada por fosforilação de tetrâmeros altamente ativos de PKM2 em dímeros inativos.

O gene PKM consiste em 12 exons e 11 introns . PKM1 e PKM2 são produtos de splicing diferentes do gene M (PKM1 contém o exon 9 enquanto PKM2 contém o exon 10) e diferem apenas em 23 aminoácidos dentro de um trecho de 56 aminoácidos (aa 378-434) em seu terminal carboxi . O gene PKM é regulado por proteínas ribonucleotídicas heterogêneas como hnRNPA1 e hnRNPA2. O monômero PKM2 humano tem 531 aminoácidos e é uma única cadeia dividida nos domínios A, B e C. A diferença na sequência de aminoácidos entre PKM1 e PKM2 permite que PKM2 seja regulado alostericamente por FBP e forme dímeros e tetrâmeros, enquanto PKM1 só pode formar tetrâmeros.

Isozimas em bactérias

Muitas Enterobacteriaceae, incluindo E. coli , têm duas isoformas de piruvato quinase, PykA e PykF, que são 37% idênticas em E. coli (Uniprot: PykA , PykF ). Eles catalisam a mesma reação que nos eucariotos, ou seja, a geração de ATP a partir de ADP e PEP, a última etapa da glicólise , uma etapa que é irreversível em condições fisiológicas. PykF é regulado alostericamente por FBP, que reflete a posição central de PykF no metabolismo celular. A transcrição de PykF em E. coli é regulada pelo regulador transcricional global, Cra (FruR). A PfkB mostrou ser inibida pelo MgATP em baixas concentrações de Fru-6P, e essa regulação é importante para a gliconeogênese .

Reação

Glicolise

Existem duas etapas na reação da piruvato quinase na glicólise. Primeiro, a PEP transfere um grupo fosfato para o ADP, produzindo ATP e o enolato de piruvato. Em segundo lugar, um próton deve ser adicionado ao enolato de piruvato para produzir a forma funcional de piruvato que a célula necessita. Como o substrato para a piruvato quinase é um fosfo-açúcar simples e o produto é um ATP, a piruvato quinase é uma possível enzima de base para a evolução do ciclo da glicólise e pode ser uma das enzimas mais antigas em toda a vida terrestre . O fosfoenolpiruvato pode estar presente de forma abiótica e demonstrou ser produzido com alto rendimento em uma via de glicólise da triose primitiva.

Um diagrama simples que demonstra a etapa final da glicólise, a transferência de um grupo fosfato de fosfoenolpiruvato (PEP) para adenosina difosfato (ADP) por piruvato quinase, produzindo uma molécula de piruvato e uma molécula de ATP .

Em células de levedura, a interação da piruvato quinase de levedura (YPK) com PEP e seu efetor alostérico Frutose 1,6-bifosfato (FBP,) foi encontrada para ser aumentada pela presença de Mg 2+ . Portanto, concluiu-se que o Mg 2+ é um importante cofator na catálise da PEP em piruvato pela piruvato quinase. Além disso, o íon metálico Mn 2+ mostrou ter um efeito semelhante, mas mais forte sobre YPK do que Mg 2+ . A ligação de íons metálicos aos locais de ligação de metal na piruvato quinase aumenta a velocidade dessa reação.

A reação catalisada pela piruvato quinase é a etapa final da glicólise. É uma das três etapas limitantes dessa via. As etapas de limitação de taxa são as etapas mais lentas e reguladas de uma via e, portanto, determinam a taxa geral da via. Na glicólise, as etapas limitantes da taxa são acopladas à hidrólise do ATP ou à fosforilação do ADP, fazendo com que a via seja energeticamente favorável e essencialmente irreversível nas células. Esta etapa final é altamente regulada e deliberadamente irreversível porque o piruvato é um bloco de construção intermediário crucial para outras vias metabólicas. Uma vez que o piruvato é produzido, ele entra no ciclo de TCA para produção adicional de ATP em condições aeróbias ou é convertido em ácido lático ou etanol em condições anaeróbicas.

Gliconeogênese: a reação reversa

A piruvato quinase também atua como uma enzima reguladora da gliconeogênese , uma via bioquímica na qual o fígado gera glicose a partir do piruvato e outros substratos. A gliconeogênese utiliza fontes não-carboidratos para fornecer glicose ao cérebro e aos glóbulos vermelhos em tempos de inanição, quando as reservas diretas de glicose se esgotam. Durante o estado de jejum , a piruvato quinase é inibida, evitando assim que o "vazamento" do fosfoenolpiruvato seja convertido em piruvato; em vez disso, o fosfoenolpiruvato é convertido em glicose por meio de uma cascata de reações de gliconeogênese . Embora utilize enzimas semelhantes, a gliconeogênese não é o reverso da glicólise. Em vez disso, é uma via que contorna as etapas irreversíveis da glicólise. Além disso, a gliconeogênese e a glicólise não ocorrem simultaneamente na célula em um dado momento, pois são reguladas reciprocamente pela sinalização celular. Uma vez que a via da gliconeogênese esteja completa, a glicose produzida é expelida do fígado, fornecendo energia para os tecidos vitais em jejum.

Regulamento

A glicólise é altamente regulada em três de suas etapas catalíticas: a fosforilação da glicose pela hexocinase , a fosforilação da frutose-6-fosfato pela fosfofrutocinase e a transferência do fosfato de PEP para ADP pela piruvato quinase. Em condições de tipo selvagem, todas as três dessas reações são irreversíveis, têm uma grande energia livre negativa e são responsáveis ​​pela regulação desta via. A atividade da piruvato quinase é mais amplamente regulada por efetores alostéricos, modificadores covalentes e controle hormonal. No entanto, o regulador da piruvato quinase mais significativo é a frutose-1,6-bifosfato (FBP), que atua como um efetor alostérico para a enzima.

Efetores alostéricos

A regulação alostérica é a ligação de um efetor a um local da proteína diferente do local ativo, causando uma mudança conformacional e alterando a atividade daquela determinada proteína ou enzima. A piruvato quinase foi encontrada para ser alostericamente ativada por FBP e alostericamente inativada por ATP e alanina. A tetramerização da piruvato quinase é promovida por FBP e serina, enquanto a dissociação do tetrâmero é promovida pela L-cisteína.

Frutose-1,6-bisfosfato

FBP é a fonte mais significativa de regulação porque vem de dentro da via da glicólise. O FBP é um intermediário glicolítico produzido a partir da fosforilação da frutose 6-fosfato . O FBP se liga ao sítio de ligação alostérico no domínio C da piruvato quinase e altera a conformação da enzima, causando a ativação da atividade da piruvato quinase. Como um intermediário presente na via glicolítica, o FBP fornece estimulação feedforward porque quanto maior a concentração de FBP, maior a ativação alostérica e a magnitude da atividade da piruvato quinase. A piruvato quinase é mais sensível aos efeitos do FBP. Como resultado, o restante dos mecanismos regulatórios servem como modificação secundária.

Modificadores covalentes

Os modificadores covalentes atuam como reguladores indiretos, controlando a fosforilação, desfosforilação, acetilação, succinilação e oxidação de enzimas, resultando na ativação e inibição da atividade enzimática. No fígado, o glucagon e a epinefrina ativam a proteína quinase A , que atua como um modificador covalente pela fosforilação e desativação da piruvato quinase. Em contraste, a secreção de insulina em resposta à elevação do açúcar no sangue ativa a fosfoproteína fosfatase I, causando a desfosforilação e a ativação da piruvato quinase para aumentar a glicólise. A mesma modificação covalente tem efeito oposto nas enzimas da gliconeogênese. Esse sistema de regulação é responsável por evitar um ciclo fútil por meio da prevenção da ativação simultânea da piruvato quinase e das enzimas que catalisam a gliconeogênese.

Proteína de ligação ao elemento de resposta a carboidratos (ChREBP)

Verificou- se que a ChREBP é uma proteína essencial na transcrição do gene da isoenzima L da piruvato quinase. Os domínios de ChREBP são locais alvo para a regulação da piruvato quinase por glicose e cAMP. Especificamente, a ChREBP é ativada por uma alta concentração de glicose e inibida por AMPc. A glicose e o cAMP atuam em oposição um ao outro por meio da regulação do modificador covalente. Enquanto o cAMP se liga aos locais de ligação de Ser196 e Thr666 de ChREBP, causando a fosforilação e inativação da piruvato quinase; a glicose se liga aos locais de ligação Ser196 e Thr666 de ChREBP, causando a desfosforilação e ativação da piruvato quinase. Como resultado, o cAMP e o excesso de carboidratos demonstraram desempenhar um papel indireto na regulação da piruvato quinase.

Controle hormonal

A fim de evitar um ciclo fútil , a glicólise e a gliconeogênese são fortemente reguladas para garantir que nunca operem na célula ao mesmo tempo. Como resultado, a inibição da piruvato quinase pelo glucagon, AMP cíclico e epinefrina, não apenas desliga a glicólise, mas também estimula a gliconeogênese. Alternativamente, a insulina interfere com o efeito do glucagon, AMP cíclico e epinefrina, fazendo com que a piruvato quinase funcione normalmente e a gliconeogênese seja desligada. Além disso, descobriu-se que a glicose inibe e interrompe a gliconeogênese, deixando a atividade da piruvato quinase e a glicólise inalteradas. No geral, a interação entre os hormônios desempenha um papel fundamental no funcionamento e na regulação da glicólise e da gliconeogênese na célula.

Efeito inibidor da metformina

A metformina, ou dimetilbiguanida , é o principal tratamento usado para o diabetes tipo 2. Foi demonstrado que a metformina afeta indiretamente a piruvato quinase por meio da inibição da gliconeogênese. Especificamente, a adição de metformina está ligada a uma diminuição acentuada no fluxo de glicose e aumento no fluxo de lactato / piruvato de várias vias metabólicas. Embora a metformina não afete diretamente a atividade da piruvato quinase, ela causa uma diminuição na concentração de ATP. Devido aos efeitos inibitórios alostéricos do ATP na piruvato quinase, uma diminuição no ATP resulta na diminuição da inibição e na estimulação subsequente da piruvato quinase. Consequentemente, o aumento na atividade da piruvato quinase direciona o fluxo metabólico através da glicólise, ao invés da gliconeogênese.

Regulação do gene

Proteínas ribonucleotídicas heterogêneas (hnRNPs) podem atuar no gene PKM para regular a expressão das isoformas M1 e M2. As isoformas PKM1 e PKM2 são variantes de splice do gene PKM que diferem por um único exon. Vários tipos de hnRNPs, como hnRNPA1 e hnRNPA2, entram no núcleo durante as condições de hipóxia e modulam a expressão de modo que PKM2 seja regulado para cima. Hormônios como a insulina regulam positivamente a expressão de PKM2, enquanto hormônios como tri-iodotironina (T3) e glucagon auxiliam na regulação negativa de PKM2.

Aplicações clínicas

Deficiência

Defeitos genéticos dessa enzima causam a doença conhecida como deficiência de piruvato quinase . Nessa condição, a falta de piruvato quinase retarda o processo de glicólise. Esse efeito é especialmente devastador em células que não possuem mitocôndrias , porque essas células devem usar a glicólise anaeróbica como sua única fonte de energia porque o ciclo do TCA não está disponível. Por exemplo, os glóbulos vermelhos , que em um estado de deficiência de piruvato quinase, tornam-se rapidamente deficientes em ATP e podem sofrer hemólise . Portanto, a deficiência de piruvato quinase pode causar anemia hemolítica não esferocítica crônica (CNSHA).

Mutação do gene PK-LR

A deficiência de piruvato quinase é causada por um traço autossômico recessivo. Os mamíferos têm dois genes da piruvato quinase, PK-LR (que codifica para as isoenzimas L e R da piruvato quinase) e PK-M (que codifica a isozima M1 da piruvato quinase), mas apenas PKLR codifica para a isoenzima vermelha do sangue que afeta a deficiência de piruvato quinase. Mais de 250 mutações no gene PK-LR foram identificadas e associadas à deficiência de piruvato quinase. O teste de DNA guiou a descoberta da localização do PKLR no cromossomo 1 e o desenvolvimento de testes de sequenciamento de genes diretos para diagnosticar molecularmente a deficiência de piruvato quinase.

Aplicações da inibição da piruvato quinase

Inibição de espécies reativas de oxigênio (ROS)

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são formas quimicamente reativas de oxigênio. Em células pulmonares humanas, ROS demonstrou inibir a isozima M2 da piruvato quinase (PKM2). ROS atinge esta inibição oxidando Cys358 e inativando PKM2. Como resultado da inativação de PKM2, o fluxo de glicose não é mais convertido em piruvato, mas é utilizado na via da pentose fosfato, resultando na redução e desintoxicação de ROS. Dessa forma, os efeitos deletérios das ROS são aumentados e causam maior estresse oxidativo nas células pulmonares, levando à potencial formação de tumor. Este mecanismo inibitório é importante porque pode sugerir que os mecanismos regulatórios em PKM2 são responsáveis ​​por auxiliar a resistência das células cancerosas ao estresse oxidativo e aumentar a tumorigênese.

Inibição de fenilalanina

Verificou-se que a fenilalanina funciona como um inibidor competitivo da piruvato quinase no cérebro. Embora o grau de atividade inibitória da fenilalanina seja semelhante em células fetais e adultas, as enzimas nas células cerebrais fetais são significativamente mais vulneráveis ​​à inibição do que aquelas nas células cerebrais adultas. Um estudo de PKM2 em bebês com a doença genética cerebral fenilcetonúrica (PKU), mostrou níveis elevados de fenilalanina e diminuição da eficácia de PKM2. Este mecanismo inibitório fornece informações sobre o papel da piruvato quinase no dano às células cerebrais.

Piruvato Quinase em Câncer

As células cancerosas possuem maquinaria metabólica caracteristicamente acelerada e acredita-se que a piruvato quinase tenha um papel no câncer. Quando comparadas às células saudáveis, as células cancerosas têm níveis elevados da isoforma PKM2, especificamente o dímero de baixa atividade. Portanto, os níveis séricos de PKM2 são usados ​​como marcadores de câncer. O dímero de baixa atividade permite o acúmulo de fosfoenol piruvato (PEP), deixando grandes concentrações de intermediários glicolíticos para a síntese de biomoléculas que serão eventualmente utilizadas pelas células cancerosas. A fosforilação de PKM2 pela proteína quinase 1 ativada por mitogênio (ERK2) causa alterações conformacionais que permitem que PKM2 entre no núcleo e regule a expressão do gene glicolítico necessária para o desenvolvimento do tumor. Alguns estudos afirmam que há uma mudança na expressão de PKM1 para PKM2 durante a carcinogênese. Microambientes tumorais como a hipóxia ativam fatores de transcrição como o fator indutível por hipóxia para promover a transcrição de PKM2, que forma um ciclo de feedback positivo para aumentar sua própria transcrição.

Distribuição de anormalidades dos glóbulos vermelhos em todo o mundo

Alternativas

Uma enzima reversível com função semelhante, piruvato fosfato dicinase (PPDK), é encontrada em algumas bactérias e foi transferida para vários grupos de eucariotos anaeróbios (por exemplo, Streblomastix , Giardia , Entamoeba e Trichomonas ), parece através do gene horizontal transferir em duas ou mais ocasiões. Em alguns casos, o mesmo organismo terá piruvato quinase e PPDK.

Referências

links externos


Via metabólica da glicólise