Quantificação de ácido nucléico - Nucleic acid quantitation

Densidade óptica da amostra de ribossomo. Os comprimentos de onda importantes de 260nm e 280nm são rotulados.

Em biologia molecular , a quantificação de ácidos nucléicos é comumente realizada para determinar as concentrações médias de DNA ou RNA presentes em uma mistura, bem como sua pureza. As reações que usam ácidos nucléicos geralmente requerem quantidades e pureza específicas para um desempenho ideal. Até o momento, existem duas abordagens principais usadas pelos cientistas para quantificar ou estabelecer a concentração de ácidos nucléicos (como DNA ou RNA) em uma solução. Trata-se de quantificação espectrofotométrica e marcação de fluorescência UV na presença de um corante de DNA.

Análise espectrofotométrica

Uma das práticas mais comumente usadas para quantificar DNA ou RNA é o uso de análise espectrofotométrica usando um espectrofotômetro . Um espectrofotômetro é capaz de determinar as concentrações médias dos ácidos nucléicos DNA ou RNA presentes em uma mistura, bem como sua pureza.

A análise espectrofotométrica é baseada nos princípios de que os ácidos nucléicos absorvem a luz ultravioleta em um padrão específico. No caso do DNA e do RNA, uma amostra é exposta à luz ultravioleta no comprimento de onda de 260 nanômetros (nm) e um fotodetector mede a luz que passa pela amostra. Parte da luz ultravioleta vai passar e parte será absorvida pelo DNA / RNA. Quanto mais luz for absorvida pela amostra, maior será a concentração de ácido nucleico na amostra. O efeito resultante é que menos luz atingirá o fotodetector e isso produzirá uma maior densidade óptica (OD)

Usando a lei de Beer-Lambert , é possível relacionar a quantidade de luz absorvida com a concentração da molécula absorvente. A um comprimento de onda de 260 nm, o coeficiente de extinção médio para DNA de fita dupla é 0,020 (μg / ml) -1 cm -1 , para DNA de fita simples é 0,027 (µg / ml) -1 cm -1 , para DNA de fita simples de RNA de fita é 0,025 (μg / ml) -1 cm -1 e para oligonucleotídeos de fita simples curtos é dependente do comprimento e da composição da base. Assim, uma absorvância (A) de 1 corresponde a uma concentração de 50 μg / ml para DNA de fita dupla. Este método de cálculo é válido até um A de pelo menos 2. Um coeficiente de extinção mais preciso pode ser necessário para oligonucleotídeos; estes podem ser previstos usando o modelo do vizinho mais próximo .

Cálculos

A densidade óptica é gerada a partir da equação:

Densidade óptica = Log (intensidade da luz incidente / intensidade da
luz transmitida)

Em termos práticos, uma amostra que não contém DNA ou RNA não deve
absorver qualquer luz ultravioleta e, portanto, produzir uma DO de 0

Densidade óptica = Log (100/100) = 0

Ao usar a análise espectrofotométrica para determinar a concentração de DNA ou RNA, a lei de Beer-Lambert é usada para determinar concentrações desconhecidas sem a necessidade de curvas padrão. Em essência, a Lei de Beer Lambert torna possível relacionar a quantidade de luz absorvida com a concentração da molécula absorvente. As seguintes unidades de absorbância em fatores de conversão de concentração de ácido nucleico são usadas para converter OD em concentração de amostras de ácido nucleico desconhecidas:

DsDNA A260 = 50 µg / ml
A260 ssDNA = 33 µg / ml
A260 ssRNA = 40 µg / ml

Fatores de conversão

Ao usar um comprimento de caminho de 10 mm , basta multiplicar o DO pelo fator de conversão para determinar a concentração. Exemplo, uma amostra de dsDNA 2,0 OD corresponde a uma amostra com uma concentração de 100 µg / ml.

Ao usar um comprimento de caminho menor que 10 mm, o OD resultante será reduzido por um fator de 10 / comprimento de caminho. Usando o exemplo acima com um comprimento de caminho de 3 mm, a DO para a amostra de 100 µg / ml seria reduzida para 0,6. Para normalizar a concentração para um equivalente de 10 mm, o seguinte é feito:

0,6 OD X (10/3) * 50 µg / ml = 100 µg / ml

A maioria dos espectrofotômetros permite a seleção do tipo de ácido nucléico e do comprimento do caminho de modo que a concentração resultante seja normalizada para o comprimento do caminho de 10 mm, que é baseado nos princípios da lei de Beer .

A260 como medida de quantidade

A "unidade A260" é usada como medida de quantidade de ácidos nucléicos. Uma unidade A260 é a quantidade de ácido nucleico contido em 1 mL e produzindo uma DO de 1. Os mesmos fatores de conversão se aplicam e, portanto, em tais contextos:

1 unidade A260 dsDNA = 50 µg
1 unidade A260 ssDNA = 33 µg
1 unidade A260 ssRNA = 40 µg

Pureza da amostra (proporções 260: 280/260: 230)

É comum que as amostras de ácido nucleico sejam contaminadas com outras moléculas (ou seja, proteínas, compostos orgânicos, outros). O benefício secundário de usar análise espectrofotométrica para quantificação de ácido nucleico é a capacidade de determinar a pureza da amostra usando o cálculo de 260 nm: 280 nm. A razão da absorbância em 260 e 280 nm (A 260/280 ) é usada para avaliar a pureza dos ácidos nucléicos. Para DNA puro, A 260/280 é amplamente considerado ~ 1.8, mas foi argumentado que pode ser traduzido - devido a erros numéricos no artigo original de Warburg - em uma mistura de 60% de proteína e 40% de DNA. A proporção para RNA puro A 260/280 é de ~ 2,0. Essas proporções são comumente usadas para avaliar a quantidade de contaminação de proteína que resta do processo de isolamento de ácido nucleico, uma vez que as proteínas são absorvidas a 280 nm.

A razão de absorbância em 260 nm vs 280 nm é comumente usada para avaliar a contaminação de DNA de soluções de proteína , uma vez que as proteínas (em particular, os aminoácidos aromáticos) absorvem luz em 280 nm. O inverso, no entanto, não é verdade - é necessária uma quantidade relativamente grande de contaminação de proteína para afetar significativamente a proporção 260: 280 em uma solução de ácido nucleico.

A razão 260: 280 tem alta sensibilidade para contaminação de ácido nucleico na proteína:

% proteína % ácido nucleico Proporção de 260: 280
100 0 0,57
95 5 1.06
90 10 1,32
70 30 1,73

A razão 260: 280 carece de sensibilidade para contaminação de proteínas em ácidos nucleicos (tabela mostrada para RNA, 100% DNA é aproximadamente 1,8):

% ácido nucleico % proteína Proporção de 260: 280
100 0 2,00
95 5 1,99
90 10 1,98
70 30 1,94

Essa diferença se deve ao coeficiente de atenuação de massa muito maior que os ácidos nucléicos têm em 260 nm e 280 nm, em comparação com as proteínas. Por causa disso, mesmo para concentrações relativamente altas de proteína, a proteína contribui relativamente pouco para a absorbância 260 e 280. Embora a contaminação da proteína não possa ser avaliada de forma confiável com uma proporção de 260: 280, isso também significa que ela contribui com poucos erros para a estimativa da quantidade de DNA.

Identificação de contaminação

O exame dos espectros da amostra pode ser útil na identificação de que existe um problema com a pureza da amostra.

Tabela de fatores de contaminação potencial
Razão Leitura baixa Leitura alta
A260 / A230
  • Transporte de carboidratos (geralmente um problema com plantas)
  • Fenol residual da extração de ácido nucleico
  • Guanidina residual (frequentemente usada em kits baseados em coluna)
  • Glicogênio usado para precipitação.
  • Fazendo uma medição em branco em um pedestal sujo.
  • Usando uma solução inadequada para a medição do branco. A solução em branco deve ter o mesmo pH e força iônica semelhante à solução da amostra. Exemplo: o uso de água para a medição em branco para amostras dissolvidas em TE pode resultar em baixas razões 260/230.
A260 / A280
  • Fenol residual ou outro reagente associado ao protocolo de extração.
  • Uma concentração muito baixa (<10 ng / μl) de ácido nucleico.
  • RNA residual da extração de ácido nucleico.

* As altas taxas de pureza 260/280 normalmente não são indicativas de nenhum problema.

Outros contaminantes comuns

  • A contaminação por fenol , que é comumente usado na purificação de ácido nucleico, pode prejudicar significativamente as estimativas de quantificação. O fenol é absorvido com um pico a 270 nm e A 260/280 de 1,2. As preparações de ácido nucléico não contaminadas por fenol devem ter um A 260/280 de cerca de 2. A contaminação por fenol pode contribuir significativamente para a superestimação da concentração de DNA.
  • A absorção a 230 nm pode ser causada por contaminação por íon fenolato , tiocianatos e outros compostos orgânicos. Para uma amostra de RNA puro, o A 230: 260: 280 deve ser em torno de 1: 2: 1, e para uma amostra de DNA puro, o A 230: 260: 280 deve ser em torno de 1: 1.8: 1.
  • Absorção em 330 nm e superior indica partículas contaminando a solução, causando dispersão de luz na faixa do visível. O valor em uma amostra de ácido nucleico puro deve ser zero.
  • Podem ocorrer valores negativos se uma solução incorreta for usada como branco. Alternativamente, esses valores podem surgir devido à fluorescência de um corante na solução.

Análise com marcação de corante fluorescente

Um método alternativo para avaliar a concentração de DNA e RNA é marcar a amostra com uma etiqueta fluorescente , que é um corante fluorescente usado para medir a intensidade dos corantes que se ligam aos ácidos nucléicos e seletivamente fluorescem quando ligados (por exemplo, brometo de etídio ). Este método é útil para casos em que a concentração é muito baixa para avaliar com precisão com espectrofotometria e em casos onde contaminantes absorvendo a 260 nm tornam impossível a quantificação precisa por esse método. O benefício da quantificação por fluorescência de DNA e RNA é a sensibilidade aprimorada em relação à análise espectrofotométrica . No entanto, esse aumento na sensibilidade acarreta um preço mais alto por amostra e um processo de preparação de amostra mais demorado .

Existem duas maneiras principais de abordar isso. "Spotting" envolve colocar uma amostra diretamente em um gel de agarose ou filme plástico . O corante fluorescente está presente no gel de agarose ou é adicionado em concentrações apropriadas às amostras no filme plástico. Um conjunto de amostras com concentrações conhecidas é colocado ao lado da amostra. A concentração da amostra desconhecida é então estimada por comparação com a fluorescência dessas concentrações conhecidas. Alternativamente, pode-se executar a amostra através de um gel de agarose ou poliacrilamida , ao lado de algumas amostras de concentração conhecida. Tal como acontece com o teste local, a concentração é estimada através da comparação da intensidade fluorescente com as amostras conhecidas.

Se os volumes de amostra forem grandes o suficiente para usar microplacas ou cubetas , as amostras carregadas com corante também podem ser quantificadas com um fotômetro de fluorescência . O volume mínimo da amostra começa em 0,3 μl

Até o momento, não existe um método de fluorescência para determinar a contaminação por proteína de uma amostra de DNA que seja semelhante à versão espectrofotométrica de 260 nm / 280 nm.

Veja também

Referências

links externos