Resumo de restrição - Restriction digest

Uma digestão de restrição é um procedimento usado em biologia molecular para preparar DNA para análise ou outro processamento. Às vezes é denominado fragmentação de DNA (este termo também é usado para outros procedimentos). Hartl e Jones o descrevem desta forma:

Essa técnica enzimática pode ser usada para clivar moléculas de DNA em locais específicos, garantindo que todos os fragmentos de DNA que contêm uma sequência particular em um local particular tenham o mesmo tamanho; além disso, cada fragmento que contém a sequência desejada tem a sequência localizada exatamente na mesma posição dentro do fragmento. O método de clivagem faz uso de uma importante classe de enzimas de clivagem de DNA isoladas principalmente de bactérias. Essas enzimas são chamadas de endonucleases de restrição ou enzimas de restrição e são capazes de clivar moléculas de DNA nas posições em que determinadas sequências curtas de bases estão presentes.

O DNA digerido resultante é muitas vezes amplificado seletivamente usando reação em cadeia da polimerase (PCR), tornando-o mais adequado para técnicas analíticas, como eletroforese em gel de agarose e cromatografia . É usado em impressões digitais genéticas , subclonagem de plasmídeos e análise de RFLP .

Site de restrição

Uma determinada enzima de restrição corta segmentos de DNA dentro de uma sequência de nucleotídeos específica , no que é chamado de sítio de restrição . Essas sequências de reconhecimento têm normalmente quatro, seis, oito, dez ou doze nucleotídeos de comprimento e geralmente palindrômicas (ou seja, a mesma sequência de nucleotídeos na direção 5 '- 3'). Como existem muitas maneiras de organizar os quatro nucleotídeos que compõem o DNA (Adenina, Timina, Guanina e Citosina) em uma sequência de quatro a doze nucleotídeos, as sequências de reconhecimento tendem a ocorrer por acaso em qualquer sequência longa. Enzimas de restrição específicas para centenas de sequências distintas foram identificadas e sintetizadas para venda a laboratórios e, como resultado, vários "locais de restrição" potenciais aparecem em quase qualquer gene ou locus de interesse em qualquer cromossomo. Além disso, quase todos os plasmídeos artificiais incluem um poliligante (muitas vezes totalmente sintético) (também denominado "sítio de clonagem múltipla") que contém dezenas de sequências de reconhecimento de enzimas de restrição em um segmento muito curto de DNA. Isso permite a inserção de quase qualquer fragmento específico de DNA em vetores de plasmídeo , que podem ser eficientemente "clonados" por inserção em células bacterianas em replicação.

Após digestão de restrição, o DNA pode então ser analisado usando eletroforese em gel de agarose . Na eletroforese em gel, uma amostra de DNA é primeiro "carregada" em uma placa de gel de agarose (literalmente pipetada em pequenos poços em uma das extremidades da placa). O gel é então submetido a um campo elétrico, que atrai o DNA com carga negativa através dele. As moléculas viajam em taxas diferentes (e, portanto, acabam em distâncias diferentes) dependendo de sua carga líquida (partículas mais carregadas viajam mais adiante) e do tamanho (partículas menores viajam mais longe). Uma vez que nenhuma das quatro bases de nucleotídeos carrega qualquer carga, a carga líquida torna-se insignificante e o tamanho é o principal fator que afeta a taxa de difusão através do gel. A carga líquida no DNA é produzida pelo esqueleto açúcar-fosfato . Isso está em contraste com as proteínas, nas quais não há "estrutura" e a carga líquida é gerada por diferentes combinações e números de aminoácidos carregados .

Possíveis usos

A digestão de restrição é mais comumente usada como parte do processo de clonagem molecular do fragmento de DNA em um vetor (como um vetor de clonagem ou um vetor de expressão ). O vetor contém tipicamente um sítio de clonagem múltipla onde muitos sítios de restrição podem ser encontrados, e um pedaço estranho de DNA pode ser inserido no vetor cortando primeiro os sítios de restrição no vetor, bem como o fragmento de DNA, seguido pela ligação do fragmento de DNA no vetor.

Os resumos de restrição também são necessários para realizar qualquer uma das seguintes técnicas analíticas:

Várias enzimas de restrição

Existem vários tipos de enzimas de restrição, cada uma das quais corta o DNA de maneira diferente. As enzimas de restrição mais comumente usadas são a endonuclease de restrição do Tipo II (veja o artigo sobre Enzimas de restrição para exemplos). Existem alguns que cortam uma sequência de três pares de bases, enquanto outros podem cortar quatro, seis e até oito. Cada enzima tem propriedades distintas que determinam a eficiência de seu corte e em que condições. A maioria dos fabricantes que produzem essas enzimas geralmente fornecem uma solução tampão específica que contém a mistura única de cátions e outros componentes que ajudam a enzima a cortar da forma mais eficiente possível. Diferentes enzimas de restrição também podem ter diferentes temperaturas ótimas sob as quais funcionam.

Observe que, para uma digestão eficiente do DNA, o local de restrição não deve estar localizado no final de um fragmento de DNA. As enzimas de restrição podem requerer um número mínimo de pares de bases entre o local de restrição e o final do DNA para que a enzima funcione de forma eficiente. Este número pode variar entre as enzimas, mas para as enzimas de restrição mais comumente usadas, cerca de 6 a 10 pares de bases são suficientes.

Veja também

Referências

links externos

  • New England Biolabs - Produtor de enzimas de restrição. Este site contém informações altamente detalhadas sobre várias enzimas, suas temperaturas ideais e sequências de reconhecimento.
  • REBASE