Sistema de modificação de restrição - Restriction modification system

O sistema de modificação de restrição ( sistema RM ) é encontrado em bactérias e outros organismos procarióticos e fornece uma defesa contra DNA estranho , como aquele transmitido por bacteriófagos .

As bactérias têm enzimas de restrição , também chamadas de endonucleases de restrição , que clivam o DNA de fita dupla em pontos específicos em fragmentos, que são posteriormente degradados por outras endonucleases. Isso evita a infecção, destruindo efetivamente o DNA estranho introduzido por um agente infeccioso (como um bacteriófago ). Aproximadamente um quarto das bactérias conhecidas possui sistemas de RM e dessas cerca da metade tem mais de um tipo de sistema.

Como as sequências reconhecidas pelas enzimas de restrição são muito curtas, a própria bactéria quase certamente conterá algumas em seu genoma. Para evitar a destruição de seu próprio DNA pelas enzimas de restrição, grupos metil são adicionados. Essas modificações não devem interferir no pareamento de bases do DNA e, portanto, geralmente apenas algumas bases específicas são modificadas em cada fita.

As endonucleases clivam ligações fosfodiéster internas / não terminais. Eles fazem isso somente após reconhecerem sequências específicas no DNA, que geralmente têm de 4 a 6 pares de bases de comprimento e, muitas vezes, palíndromes .

História

O sistema RM foi descoberto pela primeira vez por Salvatore Luria e Mary Human em 1952 e 1953. Eles descobriram que o crescimento do bacteriófago dentro de uma bactéria infectada pode ser modificado, de modo que após sua liberação e reinfecção de uma bactéria relacionada, o crescimento do bacteriófago é restrito (inibido ) (também descrito por Luria em sua autobiografia nas páginas 45 e 99 em 1984). Em 1953, Jean Weigle e Giuseppe Bertani relataram exemplos semelhantes de modificação controlada pelo hospedeiro usando diferentes sistemas bacteriófagos. Trabalhos posteriores de Daisy Roulland-Dussoix e Werner Arber em 1962 e muitos outros pesquisadores subsequentes levaram ao entendimento de que a restrição era devida ao ataque e quebra do DNA do bacteriófago modificado por enzimas específicas da bactéria receptora. Um trabalho posterior de Hamilton O. Smith isolou Hin DII , a primeira da classe de enzimas agora conhecida como enzimas de restrição , enquanto Daniel Nathans mostrou que ela pode ser usada para mapeamento de restrição . Quando essas enzimas eram isoladas em laboratório, podiam ser usadas para manipulação controlada de DNA, fornecendo assim a base para o desenvolvimento da engenharia genética . Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith foram agraciados com o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1978 por seu trabalho sobre modificação de restrição.

Tipos

Existem quatro categorias de sistemas de modificação de restrição: tipo I, tipo II, tipo III e tipo IV, todos com atividade de enzima de restrição e atividade de metilase (exceto para o tipo IV que não tem atividade de metilase). Eles foram nomeados na ordem de descoberta, embora o sistema do tipo II seja o mais comum.

Os sistemas do tipo I são os mais complexos, consistindo em três polipeptídeos: R (restrição), M (modificação) e S (especificidade). O complexo resultante pode clivar e metilar o DNA. Ambas as reações requerem ATP, e a clivagem freqüentemente ocorre a uma distância considerável do local de reconhecimento. A subunidade S determina a especificidade da restrição e da metilação. A clivagem ocorre a distâncias variáveis ​​da sequência de reconhecimento, portanto, bandas discretas não são facilmente visualizadas por eletroforese em gel .

Os sistemas do tipo II são os mais simples e predominantes. Em vez de funcionar como um complexo, a metiltransferase e a endonuclease são codificadas como duas proteínas separadas e agem de forma independente (não há proteína de especificidade). Ambas as proteínas reconhecem o mesmo local de reconhecimento e, portanto, competem por atividade. A metiltransferase atua como um monômero , metilação do duplex um filamento de cada vez. A endonuclease atua como um homodímero , o que facilita a clivagem de ambas as fitas. A clivagem ocorre em uma posição definida próxima ou dentro da sequência de reconhecimento, produzindo fragmentos discretos durante a eletroforese em gel. Por esse motivo, os sistemas Tipo II são usados ​​em laboratórios para análise de DNA e clonagem de genes .

Os sistemas do tipo III têm proteínas R (res) e M (mod) que formam um complexo de modificação e clivagem. A proteína M, no entanto, pode se metilar por conta própria. A metilação também ocorre apenas em uma fita do DNA, ao contrário da maioria dos outros mecanismos conhecidos. O heterodímero formado pelas proteínas R e M compete com ele mesmo modificando e restringindo a mesma reação. Isso resulta em digestão incompleta.

Os sistemas do tipo IV não são verdadeiros sistemas RM porque contêm apenas uma enzima de restrição e não uma metilase. Ao contrário dos outros tipos, as enzimas de restrição do tipo IV reconhecem e cortam apenas o DNA modificado.

Função

Neisseria meningitidis tem múltiplos sistemas de endonuclease de restrição do tipo II que são empregados na transformação genética natural . A transformação genética natural é um processo pelo qual uma célula bacteriana receptora pode pegar DNA de uma célula bacteriana doadora vizinha e integrar esse DNA em seu genoma por recombinação. Embora os primeiros trabalhos sobre sistemas de modificação de restrição tenham se concentrado no benefício para as bactérias de se protegerem contra o DNA de bacteriófago invasor ou outro DNA estranho, agora se sabe que esses sistemas também podem ser usados ​​para restringir o DNA introduzido por transformação natural de outros membros do mesmo, ou espécies relacionadas.

Na bactéria patogênica Neisseria meningitidis (meningococos), a competência para transformação é um processo altamente evoluído e complexo onde várias proteínas na superfície bacteriana, nas membranas e no citoplasma interagem com o DNA transformador que chega. Os sistemas de restrição-modificação são abundantes no gênero Neisseria . N. meningitidis tem múltiplos sistemas de endonuclease de restrição do tipo II. Os sistemas de modificação de restrição em N. meningitidis variam em especificidade entre os diferentes clados. Esta especificidade fornece uma barreira eficiente contra a troca de DNA entre os clados. Luria, na página 99 de sua autobiografia, referiu-se a esse comportamento de restrição como "um exemplo extremo de hostilidade". A modificação de restrição parece ser o principal fator de isolamento e especiação sexual nos meningococos. Caugant e Maiden sugeriram que os sistemas de restrição-modificação em meningococos podem atuar para permitir a troca genética entre parentes muito próximos, reduzindo (mas não prevenindo completamente) a troca genética entre meningococos pertencentes a diferentes complexos clonais e espécies relacionadas.

Os sistemas RM também podem atuar como elementos genéticos egoístas , forçando sua manutenção na célula por meio da morte celular pós-regional.

Alguns vírus desenvolveram formas de subverter o sistema de modificação de restrição, geralmente modificando seu próprio DNA, adicionando grupos metil ou glicosil a ele, bloqueando assim as enzimas de restrição. Outros vírus, como os bacteriófagos T3 e T7, codificam proteínas que inibem as enzimas de restrição.

Para neutralizar esses vírus, algumas bactérias desenvolveram sistemas de restrição que apenas reconhecem e clivam o DNA modificado, mas não agem sobre o DNA não modificado do hospedeiro. Alguns procariontes desenvolveram vários tipos de sistemas de modificação de restrição.

Os sistemas de RM são mais abundantes em espécies promíscuas, onde estabelecem caminhos preferenciais de troca genética dentro e entre linhagens com sistemas de RM cognatos. Como o repertório e / ou especificidade dos sistemas de RM em linhagens bacterianas variam rapidamente, espera-se que os fluxos preferenciais de transferência genética dentro das espécies mudem constantemente, produzindo redes dependentes do tempo de transferência de genes.

Formulários

Biologia molecular

(a) Clonagem: sistemas RM podem ser clonados em plasmídeos e selecionados devido à resistência fornecida pela enzima de metilação. Assim que o plasmídeo começar a se replicar, a enzima de metilação será produzida e metilará o DNA do plasmídeo, protegendo-o de uma enzima de restrição específica.

(b) Polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição: As enzimas de restrição também são usadas para analisar a composição do DNA em relação à presença ou ausência de mutações que afetam a especificidade da especificidade de clivagem de REase. Quando o tipo selvagem e os mutantes são analisados ​​por digestão com diferentes REases, os produtos eletroforéticos em gel variam em comprimento, em grande parte porque os genes mutantes não serão clivados em um padrão semelhante ao do tipo selvagem para a presença de mutações que tornam os REases não-específicos para a sequência mutante.

Terapia de genes

O sistema de RM de bactérias foi proposto como um modelo para desenvolver genes antivirais humanos ou vacinas genômicas e terapias, uma vez que o sistema de RM desempenha um papel de defesa inato em bactérias ao restringir o tropismo de bacteriófagos. A pesquisa é sobre REases e ZFN que podem clivar o DNA de vários vírus humanos, incluindo HSV-2 , HPVs de alto risco e HIV-1 , com o objetivo final de induzir mutagênese alvo e aberrações de vírus que infectam humanos. O genoma humano já contém resquícios de genomas retrovirais que foram inativados e aproveitados para ganho próprio. De fato, os mecanismos para silenciar retroelementos genômicos L1 ativos pela exonuclease 1 de reparo de três primárias (TREX1) e complementação cruzada de reparo por excisão 1 (ERCC) parecem imitar a ação dos sistemas RM em bactérias e a junção final não homóloga ( NHEJ) que segue o uso de ZFN sem um modelo de reparo.

Um grande avanço é a criação de enzimas de restrição artificiais criadas pela ligação do domínio de clivagem de DNA FokI com uma matriz de proteínas de ligação de DNA ou matrizes de dedo de zinco, denotadas agora como nucleases de dedo de zinco (ZFN). ZFNs são uma ferramenta poderosa para edição do genoma do hospedeiro devido à sua especificidade de sequência aprimorada. ZFN trabalham em pares, sua dimerização sendo mediada in-situ por meio do domínio FoKI. Cada zinc finger array (ZFA) é capaz de reconhecer 9-12 pares de bases, resultando em 18-24 para o par. Um espaçador de 5-7 bp entre os locais de clivagem aumenta ainda mais a especificidade de ZFN, tornando-os uma ferramenta segura e mais precisa que pode ser aplicada em humanos. Um recente ensaio clínico de Fase I de ZFN para a abolição direcionada do co-receptor CCR5 para HIV-1 foi realizado.

Sua relação com elementos genéticos móveis (MGEs)

Os sistemas RM são os principais participantes na interação coevolutiva entre os elementos genéticos móveis (MGEs) e seus hospedeiros. Foi relatado que genes que codificam sistemas de RM se movem entre genomas procarióticos dentro de MGEs, como plasmídeos, profagos, sequências de inserção / transposons, elementos conjugativos integrativos (ICEs) e integrons. No entanto, descobriu-se recentemente que existem relativamente poucos sistemas de RM em plasmídeos, alguns em profagos e praticamente nenhum em fagos. Por outro lado, todos esses MGEs codificam um grande número de genes RM solitários, notadamente MTases. À luz disso, é provável que a mobilidade de RM pode ser menos dependente de MGEs e mais dependente, por exemplo, da existência de pequenos pontos de integração genômica. Também é possível que os sistemas de RM frequentemente explorem outros mecanismos, como transformação natural, vesículas, nanotubos, agentes de transferência de genes ou transdução generalizada para se mover entre os genomas.

Veja também

Referências