Estreptavidina - Streptavidin
| Estreptavidina | |||||||
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| Identificadores | |||||||
| Organismo | |||||||
| Símbolo | ? | ||||||
| UniProt | P22629 | ||||||
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Estreptavidina / ˌ s t r ɛ p t Æ v ɪ d ɪ n / é um 66,0 (tetrâmero) kDa da proteína purificada a partir da bactéria Streptomyces avidinii . Estreptavidina homo-tetrâmeros têm uma afinidade extraordinariamente alta de biotina (também conhecido como vitamina B7 ou vitamina H). Com uma constante de dissociação (K d ) da ordem de ≈10 −14 mol / L, a ligação da biotina à estreptavidina é uma das mais fortes interações não covalentes conhecidas na natureza. A estreptavidina é amplamente utilizada em biologia molecular e bionanotecnologia devido à resistência do complexo estreptavidina-biotina a solventes orgânicos, desnaturantes (por exemplo, cloreto de guanidínio ), detergentes (por exemplo , SDS , Triton X-100 ), enzimas proteolíticas e extremos de temperatura e pH.
Estrutura
A estrutura cristalina da estreptavidina com biotina ligada foi relatada por dois grupos em 1989. A estrutura foi resolvida usando difração anômala de múltiplos comprimentos de onda por Hendrickson et al. na Columbia University e usando a substituição isomorfa múltipla por Weber et al. no Departamento Central de Pesquisa e Desenvolvimento da EI DuPont. Em setembro de 2017, havia 171 estruturas depositadas no Protein Data Bank . Veja este link para uma lista completa. Os terminais N e C da proteína de comprimento total de 159 resíduos são processados para dar uma estreptavidina "central" mais curta, geralmente composta pelos resíduos 13–139; a remoção dos terminais N e C é necessária para a maior afinidade de ligação à biotina. A estrutura secundária de um monômero de estreptavidina é composta por oito fitas β antiparalelas, que se dobram para dar uma estrutura terciária de barril β antiparalela . Um local de ligação de biotina está localizado em uma extremidade de cada barril β. Quatro monômeros de estreptavidina idênticos (ou seja, quatro cilindros β idênticos) se associam para dar a estrutura quaternária tetramérica da estreptavidina. O local de ligação da biotina em cada barril consiste em resíduos do interior do barril, juntamente com um Trp120 conservado de uma subunidade vizinha. Desta forma, cada subunidade contribui para o sítio de ligação na subunidade vizinha e, portanto, o tetrâmero também pode ser considerado um dímero de dímeros funcionais.
Origens da alta afinidade
As numerosas estruturas cristalinas do complexo estreptavidina-biotina lançaram luz sobre as origens dessa notável afinidade. Em primeiro lugar, existe uma elevada complementaridade de forma entre a bolsa de ligação e a biotina. Em segundo lugar, existe uma extensa rede de ligações de hidrogênio formadas para biotina quando no local de ligação. Existem oito ligações de hidrogênio feitas diretamente aos resíduos no local de ligação (a chamada 'primeira camada' da ligação de hidrogênio), envolvendo os resíduos Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 e Asp128. Há também uma 'segunda camada' de ligação de hidrogênio envolvendo resíduos que interagem com os resíduos da primeira camada. No entanto, a afinidade estreptavidina-biotina excede o que seria previsto apenas a partir das interações de ligações de hidrogênio, sugerindo outro mecanismo que contribui para a alta afinidade. A bolsa de ligação à biotina é hidrofóbica , e há inúmeros contatos mediados pela força de van der Waals e interações hidrofóbicas feitas com a biotina quando na bolsa, o que também é considerado responsável pela alta afinidade. Em particular, a bolsa é forrada com resíduos de triptofano conservados. Por último, a ligação da biotina é acompanhada pela estabilização de uma alça flexível conectando as fitas β 3 e 4 (L3 / 4), que se fecha sobre a biotina ligada, agindo como uma 'tampa' sobre a bolsa de ligação e contribuindo para a biotina extremamente lenta taxa de dissociação.
A maioria das tentativas de mutação da estreptavidina resulta em uma afinidade de ligação à biotina reduzida, o que é esperado em um sistema altamente otimizado. No entanto, descobriu-se que um mutante de estreptavidina recentemente projetado, denominado traptavidina, apresenta uma dissociação da biotina dez vezes mais lenta, além de uma estabilidade térmica e mecânica mais elevada. Esta diminuição da taxa de dissociação foi acompanhada por uma diminuição de duas vezes na taxa de associação.
A afinidade de ligação à biotina pode ser prejudicada por marcação química da estreptavidina, tal como com fluoróforos reativos com amina ; flavidina é um mutante de estreptavidina sem cadeias laterais de lisina, que retém boas características de ligação de biotina após tal marcação com corante fluorescente, onde o corante se acopla ao terminal amino.
Usos em biotecnologia
Entre os usos mais comuns da estreptavidina estão a purificação ou detecção de várias biomoléculas. A forte interação estreptavidina-biotina pode ser usada para anexar várias biomoléculas umas às outras ou a um suporte sólido. Condições adversas são necessárias para quebrar a interação estreptavidina-biotina, que freqüentemente desnatura a proteína de interesse que está sendo purificada. No entanto, foi demonstrado que uma curta incubação em água acima de 70 ° C quebrará reversivelmente a interação (pelo menos para DNA biotinilado) sem desnaturar a estreptavidina, permitindo a reutilização do suporte sólido de estreptavidina. Uma outra aplicação da estreptavidina é para a purificação e detecção de proteínas geneticamente modificadas com o peptídeo Strep-tag . A estreptavidina é amplamente utilizada em Western blotting e imunoensaios conjugados a alguma molécula repórter, como a peroxidase de rábano . A estreptavidina também tem sido usada no campo de desenvolvimento da nanobiotecnologia , o uso de moléculas biológicas, como proteínas ou lipídios, para criar dispositivos / estruturas em nanoescala . Neste contexto, a estreptavidina pode ser usada como um bloco de construção para ligar moléculas de DNA biotiniladas para criar estruturas de nanotubo de carbono de parede única ou até mesmo poliedros de DNA complexos. A estreptavidina tetramérica também tem sido usada como um centro em torno do qual outras proteínas podem ser organizadas, por uma etiqueta de afinidade, como Strep-tag ou AviTag, ou por fusão genética com SpyTag . A fusão com o SpyTag permitiu a geração de conjuntos com 8 ou 20 subunidades de estreptavidina. Além de uma sonda de força molecular para estudos de microscopia de força atômica , novos materiais, como redes cristalinas 3D, também foram criados. A estreptavidina tem um ponto isoelétrico ligeiramente ácido (pI) de ~ 5, mas uma forma recombinante de estreptavidina com um pI quase neutro também está disponível comercialmente.
- Imunoterapia pré-direcionada
A imunoterapia pré-direcionada usa estreptavidina conjugada a um anticorpo monoclonal contra antígenos específicos de células cancerosas, seguido por uma injeção de biotina radiomarcada para entregar a radiação apenas à célula cancerosa. Os obstáculos iniciais envolvem a saturação dos locais de ligação da biotina na estreptavidina com biotina endógena em vez da biotina radiomarcada injetada e um alto grau de exposição radioativa nos rins devido às fortes propriedades adsortivas das células da estreptavidina. Atualmente, acredita-se que esse alto nível de ligação a tipos de células aderentes, como plaquetas ativadas e melanomas, seja resultado da ligação à integrina mediada pela sequência RYD na estreptavidina.
Variantes com um número controlado de locais de ligação
- Monovalente vs. monomérico
A estreptavidina é um tetrâmero e cada subunidade se liga à biotina com igual afinidade. A multivalência é uma vantagem em aplicações como a coloração de tetrâmero de MHC , onde os efeitos de avidez melhoram a capacidade das moléculas de MHC ligadas à estreptavidina para detectar células T específicas. Em outros casos, como o uso de estreptavidina para imagens de proteínas específicas em células, a multivalência pode perturbar a função da proteína de interesse. A estreptavidina monovalente é uma forma recombinante projetada de estreptavidina que é um tetrâmero, mas apenas um dos quatro locais de ligação é funcional. Este único sítio de ligação tem afinidade de 10 −14 mol / L e não pode causar reticulação. Aplicações de estreptavidina monovalente incluem rastreamento fluorescente de receptores de superfície celular , decoração de origami de DNA e ação como um ponteiro para identificar regiões específicas para microscopia crioeletrônica .
A estreptavidina monomérica é uma forma recombinante de estreptavidina com mutações para quebrar o tetrâmero em um monômero e aumentar a solubilidade da subunidade isolada resultante. Versões monoméricas de estreptavidina têm uma afinidade para biotina de 10 −7 mol / L 10 −8 mol / L e, portanto, não são ideais para aplicações de rotulagem, mas são úteis para purificação, onde a reversibilidade é desejável.
- Divalente
Uma estreptavidina com exatamente dois locais de ligação de biotina por tetrâmero pode ser produzida pela mistura de subunidades com e sem um local de ligação de biotina funcional e purificação por cromatografia de troca iônica . Os locais de ligação funcionais aqui têm a mesma estabilidade de ligação à biotina que a estreptavidina de tipo selvagem. A estreptavidina divalente com os dois locais de ligação da biotina juntos (cis-divalente) ou separados (trans-divalente) pode ser purificada separadamente.
- Trivalente
Uma estreptavidina com exatamente três locais de ligação de biotina por tetrâmero também pode ser produzida usando o mesmo princípio para produzir estreptavidinas divalentes.
- Estreptavidinas de alta valência
As estreptavidinas de maior valência foram obtidas utilizando a química da conjugação de ligações isopeptídicas usando a tecnologia SpyTag / SpyCatcher . Isso envolve ter um tetrâmero de estreptavidina com três locais de ligação de biotina e uma estreptavidina morta fundida com SpyTag ou SpyCatcher. Quando os diferentes tetrâmeros são misturados, ocorre uma ligação covalente para permitir um maior número de locais de ligação da biotina. Seis e doze sítios de ligação de biotina por molécula foram feitos com este método.
Comparação com avidina
A estreptavidina não é a única proteína capaz de se ligar à biotina com alta afinidade. Avidina é a outra proteína de ligação à biotina mais notável. Originalmente isolada da gema de ovo, a avidina tem apenas 30% de identidade de sequência com a estreptavidina, mas estrutura secundária, terciária e quaternária quase idêntica. Avidina tem uma afinidade mais elevada para a biotina (Kd ~ 10 -15 M), mas em contraste com estreptavidina, avidina é glicosilada, carregado positivamente, tem actividade catalítica pseudo-(avidina pode melhorar a hidrólise alcalina de uma ligação éster entre biotina e um grupo nitrofenilo ) e tem uma tendência maior de agregação. Por outro lado, estreptavidina é o melhor aglutinante de conjugado de biotina; a avidina tem uma afinidade de ligação mais baixa do que a estreptavidina quando a biotina é conjugada com outra molécula, apesar da avidina ter a afinidade mais alta para a biotina livre não conjugada. Como a estreptavidina carece de qualquer modificação de carboidrato e tem um pI quase neutro , ela tem a vantagem de uma ligação não específica muito mais baixa do que a avidina. A avidina desglicosilada (NeutrAvidin) é mais comparável ao tamanho, pI e ligação não específica da estreptavidina.
Veja também
Referências
Leitura adicional
- Hutchens TW, Porath JO (setembro de 1987). "Reconhecimento de proteínas de ligantes imobilizados: promoção de adsorção seletiva" . Química Clínica . 33 (9): 1502–8. doi : 10.1093 / clinchem / 33.9.1502 . PMID 3621554 .
- Chodosh LA, Buratowski S (2001). "Purification of DNA-Binding Proteins Using Biotin / Streptavidin Affinity Systems". Current Protocols in Protein Science . Capítulo 9. 9.7.1–9.7.13. doi : 10.1002 / 0471140864.ps0907s12 . ISBN 978-0-471-14086-3. PMID 18429216 . S2CID 23660759 .
- Zimmermann RM, Cox EC (fevereiro de 1994). "DNA alongamento em superfícies de ouro funcionalizadas" . Nucleic Acids Research . 22 (3): 492–7. doi : 10.1093 / nar / 22.3.492 . PMC 523609 . PMID 8127690 .
links externos
- Entrada Swiss-Prot para o precursor da estreptavidina de Streptomyces avidinii
- Estreptavidina nos títulos de assuntos médicos da Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA (MeSH)
- Interação ovo-stremely útil Artigo bastante interessante sobre a estrutura do PDB no PDBe
Grupos que investigam e desenvolvem estreptavidina ou proteínas da família da avidina (ordem alfabética)
- Laboratório Howarth (Universidade de Oxford)
- Laboratório Hytönen (Universidade de Tampere)
- Laboratório Kulomaa (Universidade de Tampere)
- Livnah lab (Universidade Hebraica de Jerusalém)
- Park Lab (University at Buffalo)
- Laboratório Stenkamp (Universidade de Washington)
- Wong lab (Universidade de Calgary)