Expansão de repetição de trinucleotídeo - Trinucleotide repeat expansion

Uma expansão de repetição de trinucleotídeo , também conhecida como expansão de repetição de trinucleotídeo , é a mutação do DNA responsável por causar qualquer tipo de distúrbio categorizado como distúrbio de repetição de trinucleotídeo . Estes são rotulados na genética dinâmica como mutações dinâmicas . A expansão de trigêmeos é causada pelo deslizamento durante a replicação do DNA, também conhecido como replicação de DNA de "escolha de cópia". Devido à natureza repetitiva da sequência de DNA nessas regiões, estruturas 'loop out' podem se formar durante a replicação do DNA, enquanto mantém o emparelhamento de bases complementares entre a fita-mãe e a fita-filha sendo sintetizada. Se a estrutura de loop out for formada a partir da sequência na fita filha, isso resultará em um aumento no número de repetições. No entanto, se a estrutura de loop out for formada na fita pai, ocorre uma diminuição no número de repetições. Parece que a expansão dessas repetições é mais comum do que a redução. Geralmente, quanto maior a expansão, maior a probabilidade de causar doenças ou aumentar a gravidade da doença. Outros mecanismos propostos para expansão e redução envolvem a interação de moléculas de RNA e DNA.

Além de ocorrer durante a replicação do DNA , a expansão da repetição de trinucleotídeos também pode ocorrer durante o reparo do DNA . Quando uma sequência de repetição de trinucleotídeos de DNA é danificada , ela pode ser reparada por processos como recombinação homóloga , junção de extremidade não homóloga , reparo de incompatibilidade ou reparo de excisão de base . Cada um desses processos envolve uma etapa de síntese de DNA em que o deslizamento da fita pode ocorrer, levando à expansão da repetição de trinucleotídeos.

O número de repetições de trinucleotídeos parece predizer a progressão, gravidade e idade de início da doença de Huntington e distúrbios de repetição de trinucleotídeos semelhantes. Outras doenças humanas nas quais ocorre a expansão de repetições triplas são a síndrome do X frágil , várias ataxias espinocerebelares , distrofia miotônica e ataxia de Friedreich .

História

A primeira documentação de antecipação em doenças genéticas foi no século XIX. No entanto, aos olhos dos geneticistas, essa relação foi desconsiderada e atribuída ao viés de apuração ; por causa disso, levou quase 200 anos para que uma ligação entre o início da doença e as repetições de trinucleotídeos (TNR) fosse reconhecida.

As seguintes descobertas serviram como suporte para a ligação do TNR com o início da doença; a detecção de várias repetições nessas doenças demonstrou essa relação.

Por causa dessas descobertas, ideias envolvendo antecipação na doença começaram a se desenvolver, e surgiu a curiosidade sobre como as causas poderiam estar relacionadas aos TNRs. Após os avanços, os quatro mecanismos para TNRs foram determinados, e mais tipos de repetições foram identificados também. A composição e a localização da repetição são usadas para determinar o mecanismo de uma determinada expansão. A partir de 1995, também foi possível observar a formação de grampos de cabelo nas repetições de trigêmeos, que consistiam em pares de CG repetidos e um descasamento.

Durante a década após a descoberta de evidências de que o TNR ligava o início da doença, o foco foi colocado no estudo do comprimento das repetições e na dinâmica das doenças, bem como na investigação do mecanismo por trás da herança da doença entre pais e filhos. A pesquisa mostrou que existe uma relação inversa clara entre a duração das repetições nos pais e a idade de início da doença nos filhos; portanto, os comprimentos dos TNRs são usados ​​para prever a idade de início da doença, bem como o resultado no diagnóstico clínico . Além desse achado, outro aspecto das doenças, a alta variabilidade de início, foi revelado. Embora o início da HD possa ser previsto pelo exame da herança do comprimento do TNR, o início pode variar em até quatro vezes dependendo do paciente, levando à possibilidade da existência de fatores modificadores da idade para o início da doença; houve esforços notáveis ​​nesta busca. Atualmente, o comprimento da repetição CAG é considerado o maior modificador de idade de início para doenças TNR.

A detecção de TNRs foi dificultada por tecnologia e métodos limitados no início, e anos se passaram antes do desenvolvimento de maneiras suficientes para medir as repetições. Quando o PCR foi tentado pela primeira vez na detecção de TNRs, artefatos de bandas múltiplas eram predominantes nos resultados, e isso tornou o reconhecimento de TNRs problemático; na época, o debate girava em torno de se a doença era causada por quantidades menores de expansões curtas ou por uma pequena quantidade de expansões longas. Desde então, métodos precisos foram estabelecidos ao longo dos anos. Juntos, os seguintes protocolos clinicamente necessários têm 99% de precisão na medição de TNRs.

  • A reação em cadeia da polimerase de pequeno pool (SP-PCR) permite o reconhecimento de alterações repetidas e é originada da necessidade crescente de um método que forneça medições mais precisas de TNRs. Foi útil para examinar como os TNRs variam entre humanos e camundongos no sangue, esperma e células somáticas.
  • Southern blots são usados ​​para medir repetições de CGG porque as regiões ricas em CG limitam o movimento da polimerase na PCR .

Estrutura geral

Essas sequências repetitivas levam à instabilidade entre as fitas de DNA após atingir um certo número limite de repetições, o que pode resultar em deslizamento do DNA durante a replicação. As repetições triplas mais comuns e conhecidas são CAG, GCG, CTG, CGG e GAA. Durante a replicação do DNA, a fita sendo sintetizada pode se desalinhar com sua fita modelo devido à natureza dinâmica e flexibilidade dessas repetições triplas. Este deslizamento permite que o fio encontre um intermediário estável entre si por meio do emparelhamento de bases, formando uma estrutura secundária diferente de um duplex.

Localização

Em termos de localização, essas repetições triplas podem ser encontradas em regiões codificantes e não codificantes. As repetições CAG e GCN, que levam a tratos de poliglutamina e polialanina, respectivamente, são normalmente encontradas nas regiões codificantes. Na região 5 'não traduzida, as repetições CGG e CAG são encontradas e responsáveis ​​pela síndrome do X frágil e ataxia espinocerebelar 12. Na região 3' não traduzida, as repetições CTG são encontradas, enquanto as repetições GAA estão localizadas na região do íntron. Outras repetições causadoras de doenças, mas não repetições triplas, foram localizadas na região do promotor. Uma vez que o número de repetições excede os níveis normais, as expansões de repetição de tripleto (TRE) tornam-se mais prováveis ​​e o número de repetições de tripleto pode normalmente aumentar para cerca de 100 em regiões de codificação e até milhares em regiões não codificantes. Essa diferença é devido à superexpressão de glutamina e alanina, que é selecionada devido à toxicidade celular.

Intermediários

Imagens de algumas das estruturas secundárias intermediárias possíveis: (A) Triplex intramolecular, (B) Triloop, (C) Tetraloop

Dependendo da sequência da repetição, sabe-se que pelo menos três intermediários com diferentes estruturas secundárias se formam. Uma repetição CGG formará um G-quadruplex devido ao emparelhamento de bases Hoogsteen, enquanto uma repetição GAA formará um triplex devido ao superenrolamento negativo. As repetições CAG, CTG e CGG formam um grampo de cabelo. Após a formação do grampo de cabelo, o primer se realinha com a extremidade 3 'da fita recém-sintetizada e continua a síntese, levando à expansão da repetição do tripleto. A estrutura do grampo de cabelo é baseada em uma haste e um loop que contém pares de bases Watson-Crick e pares incompatíveis. Nas repetições CTG e CAG, o número de nucleotídeos presentes na alça depende se o número de repetições triplas é ímpar ou par. Um número par de repetições forma uma estrutura tetraloop, enquanto um número ímpar leva à formação de um triloop.

Instabilidade

Limiar

Na expansão de repetição de trinucleotídeos, há um certo limite ou quantidade máxima de repetições que podem ocorrer antes que uma sequência se torne instável. Uma vez que esse limite seja atingido, as repetições começarão a se expandir rapidamente, causando expansões cada vez mais longas nas gerações futuras. Uma vez que atinge esse tamanho mínimo de alelo, que normalmente é em torno de 30-40 repetições, doenças e instabilidade podem ser contraídas, mas se o número de repetições encontrado em uma sequência estiver abaixo do limite, ela permanecerá relativamente estável. Ainda não foram encontradas pesquisas suficientes para entender a natureza molecular que causa os limiares, mas os pesquisadores continuam a estudar que a possibilidade pode estar na formação da estrutura secundária quando essas repetições ocorrerem. Verificou-se que doenças associadas a expansões de repetição de trinucleotídeos continham estruturas secundárias com grampos de cabelo, triplexes e duplexes de fita desdobrada. Essas observações levaram à hipótese de que o limiar é determinado pelo número de repetições que devem ocorrer para estabilizar a formação dessas estruturas secundárias indesejadas, devido ao fato de que quando essas estruturas se formam há um aumento do número de mutações que se formarão em a sequência resultando em mais expansão de trinucleotídeos.

Influência parental

A pesquisa sugere que há uma correlação direta e importante entre o sexo do pai que transmite a mutação e o grau e fenótipo da desordem na criança. O grau de expansão repetida e se uma expansão ocorrerá ou não está diretamente relacionado a o sexo do progenitor transmissor em distúrbios de repetição de trinucleotídeos codificadores e não codificantes. Por exemplo, pesquisas relacionadas à correlação entre a repetição de trinucleotídeos CAG da doença de Huntington e a transmissão parental descobriram que há uma forte correlação entre os dois com diferenças na transmissão materna e paterna. Foi observado que a transmissão materna consiste apenas em um aumento nas unidades de repetição de 1, enquanto a transmissão paterna é tipicamente de 3 a 9 repetições extras. A transmissão paterna é quase sempre responsável por uma grande transmissão repetida, resultando no início precoce da doença de Huntington, enquanto a transmissão materna resulta em indivíduos afetados que apresentam o início dos sintomas que espelham o de sua mãe. Embora esta transmissão de uma expansão de repetição de trinucleotídeo seja considerada um resultado de “Instabilidade meiótica”, o grau em que a meiose desempenha um papel neste processo e o mecanismo não é claro e vários outros processos são previstos para desempenhar simultaneamente um papel neste processo.

Mecanismos

Troca homóloga desigual

Um mecanismo proposto, mas altamente improvável, que desempenha um papel na transmissão da expansão de trinucleotídeos ocorre durante a recombinação meiótica ou mitótica. É sugerido que durante esses processos é possível que um desalinhamento de repetição homóloga, comumente conhecido por causar deleções no locus da alfa-globina, cause a instabilidade meiótica de uma expansão de repetição de trinucleotídeo. É improvável que este processo contribua para a transmissão e presença de expansões de repetição de trinucleotídeos devido a diferenças nos mecanismos de expansão. As expansões de repetição de trinucleotídeos normalmente favorecem expansões da região CAG, mas, para que a troca homóloga desigual seja uma sugestão plausível, essas repetições teriam que passar por eventos de expansão e contração ao mesmo tempo. Além disso, várias doenças que resultam de expansões de repetição de trinucleotídeos transmitidas, como a síndrome do X Frágil, envolvem repetições de trinucleotídeos instáveis ​​no cromossomo X que não podem ser explicadas pela recombinação meiótica. A pesquisa mostrou que, embora seja improvável que a recombinação homóloga desigual seja a única causa de expansões de repetição de trinucleotídeos transmitidas, essa recombinação homóloga provavelmente desempenha um papel menor no comprimento de algumas expansões de repetição de trinucleotídeos.

Replicação de DNA

Prevê-se que os erros de replicação do DNA sejam os principais responsáveis ​​pela transmissão da expansão de repetição de trinucleotídeos em muitos modelos previstos devido à dificuldade de expansão de repetição de trinucleotídeos (TRE). Foi demonstrado que os TREs ocorrem durante a replicação do DNA em estudos in vitro e in vivo, permitindo que esses longos trechos de repetições de tripletos se agrupem rapidamente em diferentes mecanismos que podem resultar em expansões em pequena ou grande escala.

Expansões em pequena escala

Essas expansões podem ocorrer por meio do deslizamento do fio ou da ligadura do retalho. Os fragmentos de Okazaki são um elemento-chave do erro proposto na replicação do DNA. É sugerido que o pequeno tamanho dos fragmentos de Okazaki, normalmente entre 150 e 200 nucleotídeos de comprimento, torna mais provável que caiam ou "escorreguem" para fora da fita retardada, o que cria espaço para que as repetições de trinucleotídeos se liguem à cópia da fita retardada. Além desta possibilidade de mudanças de expansão de repetição de trinucleotídeos ocorrendo devido ao deslizamento de fragmentos de Okazaki, a capacidade das sequências de expansão de repetição de trinucleotídeos ricas em CG para formar estruturas especiais de DNA em grampo, toróide e triplex contribui para este modelo, sugerindo que ocorre erro durante o DNA replicação. Estruturas em gancho podem se formar como resultado da liberdade da fita retardada durante a replicação do DNA e são tipicamente observadas para se formarem em sequências de repetição de trinucleotídeos extremamente longas. A pesquisa descobriu que esta formação de grampo depende da orientação das repetições de trinucleotídeos dentro de cada fita de trinucleotídeo CAG / CTG. Observou-se que as fitas que têm formação duplex por repetições de CTG na fita principal resultam em repetições extras, enquanto aquelas sem repetições de CTG na fita principal resultam em deleções repetidas. Esses intermediários podem pausar a atividade da bifurcação de replicação com base em sua interação com as DNA polimerases por meio do deslizamento da fita. As contrações ocorrem quando a bifurcação de replicação pula o intermediário no fragmento de Okazaki. As expansões ocorrem quando o garfo inverte e reinicia, o que forma uma estrutura de pé de galinha. Esta estrutura resulta na formação do intermediário instável no filamento principal nascente, levando a TRE adicional. Além disso, esse intermediário pode evitar o reparo de incompatibilidade devido à sua afinidade com o complexo MSH-2-MSH3, que estabiliza o grampo em vez de repará-lo. Em células que não se dividem, um processo denominado flap-ligation pode ser responsável pelo TRE. A glicosilase de DNA 8-oxo-guanina remove uma guanina e forma um corte na sequência. A fita codificadora forma então uma aba devido ao deslocamento, que impede a remoção por uma endonuclease. Quando o processo de reparo termina para qualquer um dos mecanismos, o comprimento da expansão é equivalente ao número de repetições triplas envolvidas na formação do intermediário em grampo.

Expansões em grande escala

Dois mecanismos foram propostos para repetições em larga escala: troca de modelo e replicação induzida por quebra.

A troca de modelo, um mecanismo para repetições GAA em grande escala que pode dobrar o número de repetições triplas, foi proposto. As repetições GAA se expandem quando seu comprimento de repetição é maior que o comprimento do fragmento de Okazaki. Essas repetições estão envolvidas na paralisação da bifurcação de replicação, pois essas repetições formam um triplex quando a aba 5 'das repetições TTC se dobra para trás. A síntese do fragmento de Okazaki continua quando o modelo é trocado para a fita principal nascente. O fragmento de Okazaki eventualmente se liga de volta ao retalho 5 ', o que resulta em TRE.

Um mecanismo diferente, baseado na replicação induzida por quebra, foi proposto para repetições CAG em larga escala e também pode ocorrer em células que não se dividem. A princípio, esse mecanismo segue o mesmo processo do mecanismo de deslizamento do fio de pequena escala até a reversão do garfo de replicação. Uma endonuclease então cliva a estrutura do pé de galinha, o que resulta em uma quebra de fita dupla de uma extremidade. A repetição CAG dessa fita filha quebrada forma um grampo e invade a fita CAG na cromátide irmã, o que resulta na expansão dessa repetição em uma síntese de DNA em D-loop em migração. Esta síntese continua até atingir a forquilha de replicação e ser clivada, o que resulta em uma cromátide irmã expandida.

Desordens

Síndrome do X Frágil

Fundo

A síndrome do X frágil é a segunda forma mais comum de deficiência intelectual que afeta 1 em 2.000-4.000 mulheres e 1 em 4.000-8.000 homens, sendo as mulheres duas vezes mais propensas a herdar essa deficiência devido aos seus cromossomos XX. Esta deficiência surge de uma mutação no final do cromossomo X no gene FMR1 (Fragile X Mental Retardation Gene) que produz uma proteína essencial para o desenvolvimento do cérebro chamada FMRP. Indivíduos com a síndrome do X Frágil experimentam uma variedade de sintomas em vários graus que dependem do sexo e do grau de mutação, como transtornos de déficit de atenção, irritabilidade, sensibilidade a estímulos, vários transtornos de ansiedade, depressão e / ou comportamento agressivo. Alguns tratamentos para esses sintomas observados em indivíduos com a síndrome do X Frágil incluem SSRIs , medicamentos antipsicóticos, estimulantes, ácido fólico e estabilizadores de humor.

Causalidade genética

Expansões consideráveis ​​de um elemento de trinucleotídeo CGG são a causa singular do distúrbio genético masculino denominado Síndrome do X Frágil. Em homens sem Síndrome do X Frágil, o número de repetições CGG varia de 53 a 200, enquanto aqueles afetados têm mais de 200 repetições dessa sequência de trinucleotídeos localizada no final do cromossomo X na banda Xq28.3.1 . Portadores que têm repetições dentro do intervalo de 53 a 200 repetições são considerados "alelos de pré-mutação", como os alelos dentro deste intervalo se aproximam de 200, a probabilidade de expansão para uma mutação completa aumenta e os níveis de mRNA são elevados cinco vezes. A pesquisa mostrou que os indivíduos com alelos de pré-mutação na faixa de 59-69 repetições têm cerca de 30% de risco de desenvolver mutação completa em comparação com aqueles na faixa alta de ≥ 90 repetições. Portadores da síndrome do X frágil (aqueles que se enquadram na faixa de pré-mutação) geralmente têm alelos não metilados, fenótipo normal e níveis normais de mRNA FMR1 e proteína FMRP. Homens com síndrome do X frágil possuem alelos na faixa de mutação completa (> 200 repetições) com níveis de proteína FMRP muito mais baixos do que o normal e apresentam hipermetilação da região promotora do gene FMR1. Alguns homens com alelos na faixa de mutação completa experimentam metilação parcial ou nenhuma metilação, o que resulta em fenótipos apenas ligeiramente anormais devido a apenas uma ligeira regulação negativa da transcrição do gene FMR1. Alelos não metilados e parcialmente metilados na faixa de mutação apresentam níveis aumentados e normais de mRNA de FMR1 quando comparados a controles normais. Em contraste, quando os alelos não metilados atingem um número de repetição de aproximadamente 300, os níveis de transcrição são relativamente afetados e operam em níveis normais; os níveis de transcrição de repetições maiores que 300 são atualmente desconhecidos.

Silenciador do promotor

A expansão da repetição do trinucleotídeo CGG está presente no mRNA FMR1 e suas interações são responsáveis ​​pelo silenciamento do promotor . A expansão do trinucleotídeo CGG reside na região 5 'não traduzida do mRNA, que sofre hibridização para formar uma porção de repetição CGG complementar. A ligação desta repetição genômica ao mRNA resulta no silenciamento do promotor. Além desse ponto, o mecanismo de silenciamento do promotor é desconhecido e ainda está sendo investigado.

Doença de Huntington

Fundo

A doença de Huntington (DH) é uma doença neurológica de transmissão paternal dominante que afeta 1 em 15.000-20.000 pessoas em muitas populações ocidentais. A DH envolve os gânglios da base e o córtex cerebral e se manifesta como sintomas como deficiência cognitiva, motora e / ou psiquiátrica.

Causalidade

Este distúrbio autossômico dominante resulta das expansões de uma repetição de trinucleotídeos que envolve CAG no exon 1 do gene IT15. A maioria de todos os casos de DH juvenil resultam da transmissão de um elevado número de repetições de trinucleótidos CAG que resulta da gametogénese paterna . Enquanto um indivíduo sem DH tem um número de repetições CAG que se encontram dentro de um intervalo entre 9 e 37, um indivíduo com DH tem CAG normalmente tem repetições em um intervalo entre 37 e 102. A pesquisa mostrou uma relação inversa entre o número de repetições de trinucleotídeos e idade de início, no entanto, nenhuma relação entre os números de repetições de trinucleotídeos e a taxa de progressão de HD e / ou o peso corporal do indivíduo afetado foi observada. A gravidade do declínio funcional foi encontrada para ser semelhante em uma ampla gama de indivíduos com vários números de repetições CAG e diferentes idades de início, portanto, sugere-se que a taxa de progressão da doença também está ligada a outros fatores além da repetição CAG, tais como fatores ambientais e / ou genéticos.

Distrofia miotônica

Fundo

A distrofia miotônica é uma doença muscular rara na qual vários sistemas corporais são afetados. Existem quatro formas de Distrofia Miotônica: fenótipo leve e início tardio, início na adolescência / idade adulta jovem, primeira infância apresentando apenas dificuldades de aprendizagem e uma forma congênita. Indivíduos com distrofia miotônica experimentam sintomas físicos graves e debilitantes, como fraqueza muscular, problemas de batimento cardíaco e dificuldade para respirar, que podem ser melhorados por meio de tratamento para maximizar a mobilidade dos pacientes e as atividades diárias para aliviar o estresse de seus cuidadores. Os músculos dos indivíduos com Distrofia Miotônica apresentam um aumento das fibras do tipo 1, bem como um aumento da deterioração dessas fibras. Além dessas doenças físicas, descobriu-se que os indivíduos com Distrofia Miotônica experimentam diversos transtornos internalizados, como ansiedade e transtornos do humor, bem como atrasos cognitivos, transtornos do déficit de atenção , transtornos do espectro do autismo , QI mais baixo e dificuldades viso-espaciais. A pesquisa mostrou que há uma correlação direta entre o número de repetições de expansão, QI e o grau de deficiência visual-espacial de um indivíduo.

Causalidade

A distrofia miotônica resulta de uma expansão de repetição de trinucleotídeo (CTG) n que reside em uma região 3 'não traduzida de um transcrito que codifica serina / treonina quinase . Esta repetição de trinucleotídeo (CTG) n está localizada dentro dos leucócitos ; o comprimento da repetição e a idade do indivíduo estão diretamente relacionados à progressão da doença e à predominância de fibras musculares do tipo 1 . A idade e o comprimento (CTG) n têm apenas pequenos coeficientes de correlação para a progressão da doença. A pesquisa sugere que vários outros fatores desempenham um papel na progressão da doença, como mudanças na via de transdução de sinal , expressão somática e heterogeneidade celular em repetições (CTG) n.

Ataxia de Friedreich

Fundo

A ataxia de Friedreich é um distúrbio neurológico progressivo. Os indivíduos apresentam distúrbios da marcha e da fala devido à degeneração da medula espinhal e dos nervos periféricos. Outros sintomas podem incluir complicações cardíacas e diabetes. A idade típica do início dos sintomas é de 5 a 15 anos, com os sintomas piorando progressivamente com o tempo.

Causalidade

A ataxia de Friedreich é uma doença autossômica recessiva causada por uma expansão GAA no íntron do gene FXN . Este gene codifica a proteína frataxina , uma proteína mitocondrial envolvida na homeostase do ferro. A mutação prejudica a transcrição da proteína, de modo que as células afetadas produzem apenas 5-10% da frataxina das células saudáveis. Isso leva ao acúmulo de ferro na mitocôndria e torna as células vulneráveis ​​a danos oxidativos. A pesquisa mostra que o comprimento da repetição do GAA está correlacionado com a gravidade da doença.

Ponto de ocorrência

Síndrome do X Frágil

O momento preciso da ocorrência de TNR varia de acordo com a doença. Embora o momento exato para o FXS não seja certo, a pesquisa sugeriu que as primeiras expansões de CGG para esse distúrbio são vistas em oócitos primários . Foi proposto que a expansão repetida ocorre no oócito materno durante a parada do ciclo celular meiótico na prófase I , porém o mecanismo permanece nebuloso. Os alelos de pré-mutação herdados da mãe podem se expandir em alelos de mutação completa (mais de 200 repetições), resultando na diminuição da produção do produto do gene FMR-1 FMRP e causando a síndrome de retardo mental X frágil. Para as mulheres, as grandes expansões repetidas são baseadas no reparo, enquanto para os homens, o encurtamento das expansões repetidas longas é devido à replicação; portanto, seus espermatozoides carecem dessas repetições, e a herança paterna de expansões de repetição longa não ocorre. Entre as semanas 13 e 17 de desenvolvimento fetal humano , as grandes repetições CGG são encurtadas.

Distrofia miotônica tipo 1

Muitas semelhanças podem ser traçadas entre DM1 e FXS envolvendo aspectos de mutação. A herança materna completa está presente no DM1, a extensão da expansão repetida está ligada à idade materna e o primeiro exemplo de expansões é visto no estágio de duas células dos embriões pré-implantação. Existe uma correlação positiva entre a herança masculina e o comprimento do alelo. Um estudo com ratos descobriu que o momento exato da expansão da repetição do CTG era durante o desenvolvimento da espermatogônia . Em DM1 e FXS, é hipotetizado que a expansão de TNRs ocorre por meio de vários passos errados pela DNA polimerase na replicação. A incapacidade da DNA polimerase de se mover adequadamente através do TNR pode causar a transativação das transativações da polimerase (TLPs), que tentarão completar o processo de replicação e superar o bloqueio. Entende-se que, à medida que a DNA polimerase falha desta forma, as alças de fita simples resultantes deixadas para trás na fita modelo sofrem deleção, afetando o comprimento do TNR. Este processo deixa o potencial para a ocorrência de expansões de TNR.

Doença de Huntington

Na doença de Huntington (DH), o momento exato não foi determinado; no entanto, há uma série de pontos propostos durante o desenvolvimento das células germinativas nos quais se pensa que ocorre a expansão.

  • Em quatro amostras de HD examinadas, os comprimentos de expansão da repetição CAG foram mais variáveis ​​no esperma maduro do que nos espermatozoides em desenvolvimento nos testículos , levando à conclusão de que as expansões repetidas tinham uma probabilidade de ocorrer mais tarde no desenvolvimento do esperma.
  • Expansões repetidas foram observadas antes da conclusão da meiose em humanos, especificamente na primeira divisão.
  • Em células germinativas em diferenciação, as evidências sugerem que também é possível gerar expansões após a conclusão da meiose, visto que mutações maiores de HD foram encontradas em células pós-meióticas.

Ataxia espinocerebelar tipo 1

As repetições CAG da ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1) são mais frequentemente transmitidas por herança paterna e podem ser observadas semelhanças com a DH. O tamanho do trato para filhos de mães com essas repetições não apresenta qualquer grau de mudança. Como a instabilidade do TNR não está presente em camundongos fêmeas jovens, e a instabilidade e a idade das pacientes com SCA1 estão diretamente relacionadas, as expansões devem ocorrer em oócitos inativos. Parece que surgiu uma tendência de expansões maiores ocorrendo em células inativas na divisão e expansões menores ocorrendo em células que se dividem ou não.

Terapêutica

A expansão de repetição de trinucleotídeos é uma mutação do DNA responsável por causar qualquer tipo de distúrbio classificado como distúrbio de repetição de trinucleotídeos. Esses distúrbios são progressivos e afetam as sequências do genoma humano, freqüentemente no sistema nervoso. Até agora, as terapêuticas disponíveis têm apenas resultados modestos, na melhor das hipóteses, com ênfase na pesquisa e no estudo da manipulação genômica. As terapias mais avançadas disponíveis visam atingir a expressão de genes mutados usando oligonucleotídeos antisense (ASO) ou RNA de interferência (RNAi) para direcionar o RNA mensageiro (mRNA). Enquanto soluções para as intervenções desta doença são uma prioridade, RNAi e ASO apenas alcançaram estágios de ensaios clínicos.

Interferência de RNA (RNAi)

A interferência de RNA é um mecanismo que pode ser usado para silenciar a expressão de genes, o RNAi é um processo de ocorrência natural que é alavancado usando pequenos RNAs interferentes sintéticos (siRNAs) que são usados ​​para alterar a ação e a duração do processo natural de RNAi. Outro RNA sintético são os RNAs em gancho curto (shRNA), que também podem ser usados ​​para monitorar a ação e a previsibilidade do processo de RNAi.

O RNAi começa com RNase Dicer clivando um longo estande de 21-25 nucleotídeos de substratos de RNA de fita dupla em pequenos fragmentos. Esse processo resulta na criação dos duplexes de siRNA que serão usados ​​pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O RISC contém o antisense que se ligará às fitas complementares de mRNA, uma vez ligadas, são clivadas pela proteína encontrada dentro do complexo RISC denominado Argonaute 2 (Ago2) entre as bases 10 e 11 em relação à extremidade 5 '. Antes da clivagem da fita de mRNA, o antisense de fita dupla do siRNA também é clivado pelo complexo Ago2, isso deixa um guia de fita simples dentro do composto RISC que será usado para encontrar a fita de mRNA desejada, resultando neste processo para ter especificidade. Alguns problemas que podem ocorrer são se o siRNA de fita simples guia dentro do complexo RISC pode se tornar instável quando clivado e começar a se desenrolar, resultando na ligação a uma fita de mRNA desfavorável. Os guias complementares perfeitos para os RNAs alvo são facilmente reconhecidos e serão clivados dentro do complexo RISC; se houver apenas emparelhamento complementar parcial entre a fita guia e o mRNA direcionado pode causar a tradução incorreta ou desestabilização nos locais alvo.

Oligonucleotídeos antisense

Os oligonucleotídeos antisense (ASOs) são oligodesoxinucleotídeos de fita simples de fita pequena com aproximadamente 15-20 ácidos nucleicos de comprimento que podem alterar a expressão de uma proteína. O objetivo de usar esses oligonucleotídeos antisense é a diminuição da expressão da proteína de um alvo específico geralmente pela inibição da endonuclease RNase H, bem como a inibição da formação do cap 5 'ou alteração do processo de splicing. No estado nativo, os ASOs são rapidamente digeridos, o que requer o uso da ordem de fosforilação para que o ASO atravesse as membranas celulares.

Apesar dos benefícios óbvios que a terapêutica antisense pode trazer ao mundo com sua capacidade de silenciar doenças neurais, há muitos problemas com o desenvolvimento dessa terapia. Um problema é que os ASOs são altamente suscetíveis à degradação pelas nucleases dentro do corpo. Isso resulta em uma grande quantidade de modificação química ao alterar a química para permitir que as nucleases superem a degradação desses ácidos nucleicos sintéticos. Os ASOs nativos têm uma meia-vida muito curta, mesmo antes de serem filtrados por todo o corpo, especialmente no rim, e com uma carga negativa alta torna o cruzamento através do sistema vascular ou das membranas muito difícil ao tentar alcançar o DNA ou fitas de mRNA alvo. Com todas essas barreiras, as modificações químicas podem levar a efeitos devastadores ao serem introduzidas no corpo fazendo com que cada problema desenvolva cada vez mais efeitos colaterais.

Os oligonucleotídeos sintéticos são moléculas carregadas negativamente que são quimicamente modificadas para que a molécula regule a expressão do gene dentro da célula. Alguns problemas que surgem neste processo são a toxicidade e a variabilidade que podem surgir com a modificação química. O objetivo do ASO é modular a expressão gênica por meio de proteínas, o que pode ser feito de 2 maneiras complexas; a) os oligonucleotídeos dependentes de RNase H, que induzem a degradação do mRNA, e (b) os oligonucleotídeos bloqueadores estéricos, que fisicamente previnem ou inibem a progressão do splicing ou do mecanismo de tradução. A maioria dos ASOs investigados utiliza o primeiro mecanismo com a enzima Rnase H que hidrolisa uma fita de RNA, quando esta enzima é auxiliada usando os oligonucleotídeos a redução da expressão de RNA é eficientemente reduzida em 80-95% e ainda pode inibir a expressão em qualquer região de o mRNA

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Referências