Extremidades pegajosas e cegas - Sticky and blunt ends

As extremidades do DNA referem-se às propriedades da extremidade das moléculas de DNA , que podem ser pegajosas ou cegas com base na enzima que corta o DNA. A enzima de restrição pertence a uma classe maior de enzimas chamadas exonucleases e endonucleases. As exonucleases removem os nucleotídeos das extremidades, enquanto as endonucleases cortam em posições específicas dentro do DNA.

O conceito é usado em biologia molecular , na clonagem ou quando a subclonagem insere o DNA no DNA do vetor . Essas pontas podem ser geradas por enzimas de restrição que cortam o DNA - um corte escalonado gera duas pontas pegajosas, enquanto um corte reto gera pontas cegas.

Moléculas de DNA de fita simples

Uma molécula de DNA de fita simples não circular tem duas extremidades não idênticas, a extremidade 3 'e a extremidade 5' (geralmente pronunciada "extremidade três prime" e "extremidade cinco primos"). Os números referem-se à numeração dos átomos de carbono na desoxirribose , que é um açúcar que forma uma parte importante da estrutura da molécula de DNA. Na espinha dorsal do DNA, o carbono 5 'de uma desoxirribose está ligado ao carbono 3' de outra por uma ligação fosfodiéster. O carbono 5 'desta desoxirribose está novamente ligado ao carbono 3' da próxima e assim por diante.

Variações em moléculas de fita dupla

Quando uma molécula de DNA tem fita dupla, como o DNA geralmente é, as duas fitas correm em direções opostas. Portanto, uma extremidade da molécula terá a extremidade 3 'da fita 1 e a extremidade 5' da fita 2, e vice-versa na outra extremidade. No entanto, o fato de a molécula ser de duas fitas permite inúmeras variações diferentes.

Pontas cegas

A extremidade mais simples do DNA de uma molécula de fita dupla é chamada de extremidade cega . Extremidades cegas também são conhecidas como extremidades não coesas. Em uma molécula de extremidade cega, ambas as fitas terminam em um par de bases . Extremidades cegas nem sempre são desejadas em biotecnologia, pois ao usar uma DNA ligase para unir duas moléculas em uma, o rendimento é significativamente menor com extremidades cegas. Ao realizar a subclonagem, também tem a desvantagem de inserir potencialmente o DNA inserido na orientação oposta desejada. Por outro lado, as extremidades cegas são sempre compatíveis entre si. Aqui está um exemplo de um pequeno pedaço de DNA de extremidade cega: 

5'-GATCTGACTGATGCGTATGCTAGT-3'
3'-CTAGACTGACTACGCATACGATCA-5'

Saliências e pontas pegajosas

Extremidades não cegas são criadas por várias saliências . Uma saliência é um trecho de nucleotídeos desemparelhados na extremidade de uma molécula de DNA. Esses nucleotídeos desemparelhados podem estar em qualquer uma das fitas, criando saliências 3 'ou 5'. Essas saliências são, na maioria dos casos, palindrômicas.

O caso mais simples de uma saliência é um único nucleotídeo. Na maioria das vezes, é a adenosina e é criada como uma saliência 3 'por algumas polimerases de DNA . Mais comumente, isso é usado na clonagem de produtos de PCR criados por tal enzima. O produto é unido a uma molécula de DNA linear com uma saliência de timina 3 ' . Como a adenina e a timina formam um par de bases , isso facilita a união das duas moléculas por uma ligase, resultando em uma molécula circular. Aqui está um exemplo de uma saliência A: 

5'-ATCTGACTA-3'
3'-TAGACTGA-5'

Saliências mais longas são chamadas de extremidades coesivas ou aderentes . Eles são mais frequentemente criados por endonucleases de restrição quando cortam o DNA. Freqüentemente, eles cortam as duas fitas de DNA de quatro pares de bases uma da outra, criando uma saliência 5 'de quatro bases em uma molécula e uma saliência 5' complementar na outra. Essas extremidades são chamadas de coesivas, pois são facilmente unidas novamente por uma ligase.

Por exemplo, essas duas extremidades "pegajosas" são compatíveis: 

5'-ATCTGACT      + GATGCGTATGCT-3'
3'-TAGACTGACTACG        CATACGA-5'

Eles podem formar pares de bases complementares na região saliente: 

           GATGCGTATGCT-3'
5'-ATCTGACT     CATACGA-5'
3'-TAGACTGACTACG

Além disso, uma vez que endonucleases de restrição diferentes geralmente criam saliências diferentes, é possível criar um plasmídeo excisando um pedaço de DNA (usando uma enzima diferente para cada extremidade) e, em seguida, juntando-o a outra molécula de DNA com as extremidades aparadas pelas mesmas enzimas. Uma vez que as saliências devem ser complementares para que a ligase funcione, as duas moléculas só podem se juntar em uma orientação. Muitas vezes, isso é altamente desejável em biologia molecular .

Pontas desfiadas

Do outro lado de cada fita simples de DNA, normalmente vemos o par de adenina com timina e o par de citosina com guanina para formar uma fita complementar paralela, conforme descrito abaixo. Duas sequências de nucleotídeos que correspondem entre si desta maneira são referidas como complementares: 

5'-ATCTGACT-3'
3'-TAGACTGA-5'
Frayed-dna.png

Uma extremidade desgastada refere-se a uma região de uma molécula de DNA de fita dupla (ou outra de fita múltipla) próxima à extremidade com uma proporção significativa de sequências não complementares; ou seja, uma sequência em que os nucleotídeos nas fitas adjacentes não correspondem corretamente: 

5'-ATCTGACTAGGCA-3'
3'-TAGACTGACTACG-5'

O termo "desfiado" é usado porque os nucleotídeos combinados incorretamente tendem a evitar a ligação, parecendo assim com os fios de um pedaço de corda desfiado.

Embora sequências não complementares também sejam possíveis no meio de DNA de fita dupla, regiões incompatíveis longe das extremidades não são referidas como "desgastadas".

Descoberta

Ronald W. Davis descobriu as extremidades pegajosas como produto da ação do EcoRI , a endonuclease de restrição .

Força

Os links de extremidade aderente são diferentes em sua estabilidade. A energia livre de formação pode ser medida para estimar a estabilidade. As aproximações de energia livre podem ser feitas para diferentes sequências de dados relacionados a curvas de desnaturação térmica de UV de oligonucleotídeo. Também as previsões de simulações de dinâmica molecular mostram que alguns elos de extremidade pegajosa são muito mais fortes em extensão do que outros.

Referências

  • Sambrook, Joseph ; David Russell (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press , ISBN  0879695765 .