Imunodifusão radial - Radial immunodiffusion

A imunodifusão radial (RID) ou método de Mancini, imunodifusão de Mancini ou ensaio de imunodifusão radial simples, é uma técnica de imunodifusão usada em imunologia para determinar a quantidade ou concentração de um antígeno em uma amostra.

Descrição

Preparação

Uma solução contendo anticorpo é adicionada a um meio aquecido tal como ágar ou agarose dissolvido em solução salina normal tamponada . O meio derretido é então derramado em uma lâmina de microscópio ou em um recipiente aberto, como uma placa de Petri , e pode esfriar e formar um gel . Uma solução contendo o antígeno é então colocada em um poço que é perfurado no gel. A lâmina ou recipiente é então coberto ou fechado para evitar a evaporação.

O antígeno se difunde radialmente no meio, formando um círculo de precipitina que marca a fronteira entre o anticorpo e o antígeno. O diâmetro do círculo aumenta com o tempo à medida que o antígeno se difunde no meio, reage com o anticorpo e forma complexos de precipitina insolúveis . O antígeno é quantificado medindo o diâmetro do círculo de precipitina e comparando-o com os diâmetros dos círculos de precipitina formados por quantidades ou concentrações conhecidas do antígeno.

Os complexos antígeno-anticorpo são pequenos e solúveis quando em excesso de antígeno. Portanto, a precipitação perto do centro do círculo é geralmente menos densa do que perto da borda externa do círculo, onde o antígeno é menos concentrado.

A expansão do círculo atinge um ponto final e para quando o antígeno livre se esgota e quando o antígeno e o anticorpo atingem a equivalência. No entanto, a clareza e a densidade da borda externa do círculo podem continuar a aumentar depois que o círculo parar de se expandir.

Interpretação

Para a maioria dos antígenos, a área e o quadrado do diâmetro do círculo no ponto final do círculo são diretamente proporcionais à quantidade de antígeno e são inversamente proporcionais à concentração de anticorpo. Portanto, um gráfico que compara as quantidades ou concentrações de antígeno nas amostras originais com as áreas ou os quadrados dos diâmetros dos círculos de precipitina em escalas lineares geralmente será uma linha reta depois que todos os círculos atingirem seus pontos finais (método de equivalência) .

Os círculos que pequenas quantidades de antígeno criam alcançam seus pontos finais antes que os círculos que grandes quantidades criam o façam. Portanto, se as áreas ou diâmetros dos círculos forem medidos enquanto alguns, mas não todos, os círculos pararam de se expandir, esse gráfico será reto na parte que contém as menores quantidades ou concentrações de antígeno e será curvado na parte que contém o quantidades ou concentrações maiores.

Enquanto os círculos ainda estão se expandindo, um gráfico que compara as quantidades ou concentrações do antígeno em uma escala logarítmica com os diâmetros ou áreas dos círculos em uma escala linear pode ser uma linha reta (método cinético). No entanto, os círculos do precipitado são menores e menos distintos durante a expansão do que após o término da expansão. Além disso, a temperatura afeta a taxa de expansão, mas não afeta o tamanho de um círculo em seu ponto final. Além disso, a faixa de diâmetros de círculo para as mesmas quantidades ou concentrações de antígeno é menor, enquanto alguns círculos estão aumentando do que quando todos os círculos atingiram seus pontos finais.

A quantidade e a concentração de complexos insolúveis antígeno-anticorpo na borda externa do círculo aumentam com o tempo. A clareza e a densidade da borda externa do círculo, portanto, também aumentam com o tempo. Como resultado, as medidas dos tamanhos dos círculos e gráficos produzidos a partir dessas medidas são frequentemente mais precisas depois que os círculos pararam de se expandir do que quando os círculos ainda estão aumentando. Por essas razões, geralmente é mais desejável fazer medições depois que todos os círculos alcançaram seus pontos finais do que fazer medições enquanto alguns ou todos os círculos ainda estão aumentando.

As medições de grandes círculos são mais precisas do que as de pequenos círculos. Portanto, é frequentemente desejável ajustar a concentração de anticorpo e a quantidade de antígeno para assegurar que os anéis de precipitina serão grandes.

Técnicas de imunodifusão radial

Pode-se determinar a concentração de antígeno em uma amostra cuja concentração é desconhecida, encontrando sua localização em um gráfico que traça os diâmetros dos círculos de precipitina produzidos por três ou mais amostras de referência com concentrações de antígeno conhecidas. Duas técnicas costumam produzir linhas retas em tais gráficos. As técnicas produzem essas linhas em diferentes tipos de gráficos.

As técnicas e seus gráficos são:

• Medir círculos enquanto todos estão se expandindo (método cinético): gráficos de logaritmos de concentrações de antígeno vs. diâmetros de círculos de precipitina.
• Círculos de medição depois de todos atingirem seus pontos finais (método de equivalência): gráfico das concentrações de antígeno vs. quadrados de diâmetros de círculos de precipitina.

Referências

Leitura adicional

links externos