VS ribozima - VS ribozyme
A ribozima do satélite Varkud (VS) é uma enzima de RNA que realiza a clivagem de uma ligação fosfodiéster .
Introdução
Varkud satélite (VS) ribozima é o maior ribozima nucleolítica conhecido e verificou-se ser incorporado no VS ARN . VS RNA é um RNA não codificante longo existe como um RNA satélite e é encontrado na mitocôndria de Varkud-1C e algumas outras cepas de Neurospora . A ribozima VS contém características de RNAs catalíticos e introns do grupo 1 . A ribozima VS tem atividade de clivagem e ligação e pode realizar reações de clivagem e ligação com eficiência na ausência de proteínas. A ribozima VS sofre transferência horizontal de genes com outras cepas de Neurospora . As ribozimas VS não têm nada em comum com outras ribozimas nucleolíticas.
VS RNA tem uma estrutura primária, secundária e terciária única. A estrutura secundária da ribozima VS consiste em seis domínios helicoidais (Figura 1). A alça I da haste forma o domínio do substrato, enquanto a alça II-VI da haste forma o domínio catalítico. Quando esses 2 domínios são sintetizados in vitro separadamente, eles podem realizar a reação de autoclivagem por ação trans. O substrato se liga a uma fenda que é formada por duas hélices. O provável sítio ativo da ribozima é um nucleotídeo A756 muito importante. A alça A730 e o nucleotídeo A756 são críticos para sua função, uma vez que participam da atividade química de transferência fosfórica da ribozima
A origem
VS RNA é transcrito como um transcrito multimérico do VS DNA . O VS DNA contém uma região que codifica a transcriptase reversa necessária para a replicação do VS RNA. Uma vez transcrito, o VS RNA sofre uma clivagem específica do local. O VS RNA se auto-cliva em uma ligação fosfodiéster específica para produzir transcritos monoméricos e poucos multiméricos. Esses transcritos, então, passam por uma auto-ligação e formam um RNA VS circular. Este VS RNA circular é a forma predominante de VS encontrada em Neurospora . A ribozima VS é um pequeno motivo catalítico embutido neste ARN circular do VS. A maioria do VS RNA é composta por 881 nucleotídeos
Estrutura da Ribozima
No estado natural, um motivo de ribozima VS contém 154 nucleotídeos que se dobram em seis hélices. Seu RNA contém um elemento de autoclivagem que se acredita atuar no processamento de intermediários feitos através do processo de replicação . A estrutura em forma de H da ribozima é organizada por duas junções de três vias que determinam a dobra geral da ribozima. Uma característica única da estrutura da ribozima é que mesmo se a maioria da hélice IV e a extremidade distal da hélice VI fossem excluídas, não haveria perda significativa de atividade. No entanto, se os comprimentos da hélice III e V fossem alterados, haveria ser grande perda de atividade. As protuberâncias da base da ribozima, hélices II e IV, têm papéis estruturais muito importantes, pois substituí-las por outros nucleotídeos não afeta sua atividade. Basicamente, a atividade da ribozima VS é muito dependente da sequência local das duas junções de três vias. A junção de três vias presente na ribozima VS é muito semelhante à observada na pequena subunidade (23S) do rRNA.
O sítio ativo da Ribozyme
Os sítios ativos da ribozima podem ser encontrados nas junções helicoidais, as protuberâncias e os comprimentos das hélices críticas, sendo III e V. Há uma área importante encontrada na alça interna da hélice VI chamada A730, uma mudança de base única em esta alça levaria a uma diminuição da perda de atividade de clivagem, mas não ocorrem mudanças significativas no dobramento da ribozima. Outras mutações que afetam a atividade da ribozima são metilação, supressão de íons manganês tiofílicos no local A730
Possível mecanismo catalítico
O loop A730 é muito importante na atividade catalítica da ribozima. A ribozima funciona como uma estação de encaixe onde irá encaixar o substrato na fenda entre as hélices II e VI para facilitar uma interação entre o local de clivagem e o loop A730. Essa interação cria um ambiente para o qual a catálise pode prosseguir de maneira semelhante às interações vistas na ribozima em gancho . Dentro da alça A730, uma substituição de A756 por G, C ou U levará a uma perda de 300 vezes da atividade de clivagem e ligação.
A prova de que a alça A730 é o sítio ativo da ribozima VS é muito evidente e que A756 desempenha um papel importante em sua atividade. A reação de clivagem funciona por um mecanismo de reação S N 2. O ataque nucleofílico do 2'-oxigênio no 3'-fosfato criará um 2'3 'fosfato cíclico pela saída do 5'-oxigênio. A reação de ligação ocorre ao contrário, na qual o 5'-oxigênio ataca o 3'-fosfato do fosfato cíclico. A forma como ambas as reações são facilitadas é pela catálise ácido-base geral que fortalece o nucleófilo do oxigênio removendo proteínas ligadas e estabilizando os grupos de saída do oxiânion por meio da protonação. Também é importante acrescentar que se um grupo está se comportando como uma base na reação de clivagem, ele deve atuar como um ácido na reação de ligação. Os íons metálicos solvatados atuam na catálise ácido-base geral, onde os íons metálicos podem agir como um ácido de Lewis que polariza os átomos de oxigênio de fosfato. Outro fator importante na velocidade da reação de ligadura é a dependência do pH que corresponde a um pKa de 5,6, o que não é um fator na reação de clivagem. Esta dependência particular requer uma base protonada na posição A756 da ribozima.
Outra estratégia catalítica proposta é a estabilização de um fosfato pentavalente do estado de transição da reação. Este mecanismo provavelmente envolveria a formação de ligações de hidrogênio como visto na ribozima em gancho. Além disso, a proximidade dos grupos de sítios ativos entre si e sua orientação no espaço contribuiria para o mecanismo catalítico que ocorre. Isso pode aproximar o estado de transição e o substrato para que a reação de legação ocorra.
Catalisadores
Concentrações muito altas de cátions bivalentes e monovalentes aumentam a eficiência da reação de clivagem. Esses cátions facilitam o emparelhamento de bases da ribozima com o substrato. A taxa de clivagem de VS pode ser acelerada por alta concentração de cátions, bem como pelo aumento da concentração de RNA. Portanto, uma baixa concentração de qualquer um deles é limitante da taxa. O papel dos cátions é considerado neutralizador de carga no dobramento do RNA, em vez de atuar como um catalisador.
Hipótese para a evolução da VS Ribozima
1. Um fóssil molecular do mundo de RNA que manteve as funções de clivagem e ligação.
2. O VS Ribozyme posteriormente adquiriu uma ou mais de suas atividades enzimáticas.
A clivagem e ligação mediadas por RNA são encontradas nos RNAs de auto-processamento do grupo 1 e do grupo 2. VS RNA contém muitas características de sequência conservadas para introns do grupo 1. No entanto, o sítio de união da ribozima VS é diferente do sítio de união do íntron do grupo 1 e o sítio de autoclivação da ribozima VR está fora do núcleo do íntron do grupo 1. Na reação de clivagem, a ribozima VS produz fosfato 2 ', 3' -cíclico e os íntrons do grupo 1 produzem 3'-hidroxila. A similaridade funcional com os íntrons do grupo 1 e, em seguida, ser mecanicamente diferente dos íntrons, apóia esta hipótese de que a ribozima VS é uma quimera formada pela inserção de um novo RNA catalítico nos íntrons do grupo 1.
links externos
- Sequência de nucleotídeos e anotação do DNA do VS que codifica a ribozima do VS (no site do National Center for Biotechnology Information )