Supercoil de DNA - DNA supercoil
Superenrolamento de DNA refere-se ao enrolamento excessivo ou insuficiente de uma fita de DNA e é uma expressão da cepa nessa fita. O superenrolamento é importante em vários processos biológicos, como a compactação do DNA e, ao regular o acesso ao código genético, o superenrolamento do DNA afeta fortemente o metabolismo do DNA e, possivelmente, a expressão do gene. Além disso, certas enzimas, como topoisomerases, são capazes de alterar a topologia do DNA para facilitar funções como a replicação ou transcrição do DNA . Expressões matemáticas são usadas para descrever o superenrolamento comparando diferentes estados enrolados com o DNA de forma B relaxado.
Visão geral
Em um segmento de dupla hélice "relaxado" de B-DNA , as duas fitas giram em torno do eixo helicoidal uma vez a cada 10,4-10,5 pares de base da sequência . Adicionar ou subtrair torções, como algumas enzimas podem fazer, impõe tensão. Se um segmento de DNA sob tensão de torção fosse fechado em um círculo ao unir suas duas extremidades e então pudesse se mover livremente, o DNA circular se contorceria em uma nova forma, como um simples oito. Essa contorção é um superenrolamento . A forma substantiva "supercoil" é freqüentemente usada no contexto da topologia do DNA .
O DNA positivamente superenrolado (overwound) é gerado transitoriamente durante a replicação e transcrição do DNA e, se não for prontamente relaxado, inibe (regula) esses processos. A simples figura oito é a superenrolada mais simples e é a forma que um DNA circular assume para acomodar muitas ou poucas torções helicoidais. Os dois lóbulos da figura oito aparecerão girados no sentido horário ou anti-horário um em relação ao outro, dependendo se a hélice está enrolada ou não. Para cada torção helicoidal adicional sendo acomodada, os lóbulos mostrarão mais uma rotação em torno de seu eixo. Como regra geral, o DNA da maioria dos organismos é superenrolado negativamente.
As contorções lobais de um DNA circular, como a rotação dos lóbulos em forma de oito acima, são chamadas de contorção . O exemplo acima ilustra que torções e contorções são conversíveis. O superenrolamento pode ser representado matematicamente pela soma de torção e contorção. A torção é o número de voltas helicoidais no DNA e a contorção é o número de vezes que a dupla hélice se cruza sobre si mesma (essas são as superenroladas). As torções helicoidais extras são positivas e levam ao superenrolamento positivo, enquanto a torção subtrativa causa superenrolamento negativo. Muitas enzimas topoisomerase detectam o superenrolamento e o geram ou dissipam à medida que mudam a topologia do DNA.
Em parte porque os cromossomos podem ser muito grandes, os segmentos do meio podem agir como se suas extremidades estivessem ancoradas. Como resultado, eles podem ser incapazes de distribuir o excesso de torção para o resto do cromossomo ou de absorver a torção para se recuperar do enrolamento inferior - em outras palavras, os segmentos podem se tornar superenrolados . Em resposta ao superenrolamento, eles assumirão uma certa contorção, como se suas extremidades estivessem unidas.
O DNA superenrolado forma duas estruturas; um plectonema ou um toróide , ou uma combinação de ambos. Uma molécula de DNA superenrolada negativamente produzirá uma hélice canhota de início único, o toroide, ou uma hélice destros de início duplo com laços terminais, o plectonema. Os plectonemas são normalmente mais comuns na natureza, e esta é a forma que a maioria dos plasmídeos bacterianos assumirá. Para moléculas maiores, é comum a formação de estruturas híbridas - uma alça em um toroide pode se estender em um plectonema. Se todas as alças em um toróide se estendem, ele se torna um ponto de ramificação na estrutura plectonêmica. O superenrolamento do DNA é importante para o empacotamento do DNA em todas as células e parece também desempenhar um papel na expressão gênica.
Superenrolamento de DNA induzido por intercalação
Com base nas propriedades das moléculas intercaladas , ou seja, fluorescência ao se ligar ao DNA e desenrolar os pares de bases do DNA, recentemente uma técnica de molécula única foi introduzida para visualizar diretamente os plectonemas individuais ao longo do DNA superenrolado, o que permitiria ainda estudar as interações do processamento do DNA proteínas com DNA superenrolado. Nesse estudo, Sytox Orange (um corante intercalante), foi usado para induzir superenrolamento em moléculas de DNA ligadas à superfície.
Usando este ensaio, verificou-se que a sequência de DNA codifica para a posição de supercoils plectonêmicos. Além disso, descobriu-se que supercoils de DNA são enriquecidos nos locais de início da transcrição em procariotos.
Funções
Embalagem do genoma
O superenrolamento do DNA é importante para o empacotamento do DNA em todas as células. Como o comprimento do DNA pode ser milhares de vezes maior que o de uma célula, o empacotamento desse material genético na célula ou no núcleo (em eucariotos) é uma tarefa difícil. O superenrolamento do DNA reduz o espaço e permite que o DNA seja empacotado. Em procariotos, as supercoils plectonêmicas são predominantes, devido ao cromossomo circular e à quantidade relativamente pequena de material genético. Em eucariotos, o superenrolamento do DNA existe em muitos níveis de superenrolamentos plectonêmicos e solenóides, com o superenrolamento solenoidal se mostrando mais eficaz na compactação do DNA. O superenrolamento solenoidal é obtido com histonas para formar uma fibra de 10 nm. Esta fibra é posteriormente enrolada em uma fibra de 30 nm e ainda mais enrolada sobre si mesma várias vezes.
O empacotamento do DNA aumenta muito durante a mitose, quando os DNAs irmãos duplicados são segregados em células-filhas. Foi demonstrado que a condensina , um grande complexo proteico que desempenha um papel central na montagem do cromossomo mitótico, induz supercoils positivos de uma maneira dependente da hidrólise de ATP in vitro . O superenrolamento também pode desempenhar um papel importante durante a interfase na formação e manutenção de domínios de associação topológica (TADs).
Superenrolamento também é necessário para a síntese de DNA / RNA. Como o DNA deve ser desenrolado para a ação da DNA / RNA polimerase , surgirão supercoils. A região à frente do complexo da polimerase será desenrolada; esse estresse é compensado com superenroladas positivas à frente do complexo. Atrás do complexo, o DNA é rebobinado e haverá superenroladas compensatórias negativas. Topoisomerases como a DNA girase (Topoisomerase Tipo II) desempenham um papel no alívio de parte do estresse durante a síntese de DNA / RNA.
Expressão genetica
Proteínas especializadas podem descompactar pequenos segmentos da molécula de DNA quando ela é replicada ou transcrita em RNA . Mas o trabalho publicado em 2015 ilustra como o DNA se abre sozinho.
A simples torção do DNA pode expor bases internas para o exterior, sem o auxílio de nenhuma proteína. Além disso, a própria transcrição contorce o DNA em células humanas vivas, apertando algumas partes da bobina e afrouxando-a em outras. Essa tensão desencadeia mudanças na forma, principalmente abrindo a hélice para ser lida. Infelizmente, essas interações são muito difíceis de estudar porque as moléculas biológicas se transformam em formas com muita facilidade. Em 2008, observou-se que a transcrição distorce o DNA, deixando um rastro de DNA subcoiled (ou negativamente superenrolado) em seu rastro. Além disso, eles descobriram que a própria sequência de DNA afeta a forma como a molécula responde ao superenrolamento. Por exemplo, os pesquisadores identificaram uma sequência específica de DNA que regula a velocidade de transcrição; à medida que a quantidade de superenrolamento aumenta e diminui, diminui ou acelera o ritmo em que a maquinaria molecular lê o DNA. É hipotetizado que essas mudanças estruturais podem desencadear estresse em outro lugar ao longo de seu comprimento, que por sua vez, pode fornecer pontos de gatilho para a replicação ou expressão gênica. Isso implica que é um processo muito dinâmico no qual tanto o DNA quanto as proteínas influenciam o modo como o outro age e reage.
Descrição matemática
Na natureza, o DNA circular é sempre isolado como uma hélice sobre uma hélice de ordem superior, conhecida como superhélice . Em discussões sobre este assunto, a torção Watson-Crick é referida como um enrolamento "secundário" e as superhelices como um enrolamento "terciário". O esboço à direita indica uma dupla hélice Watson-Crick "relaxada" ou "circular aberta" e, ao lado dela, uma superhélice destra. A estrutura "relaxada" à esquerda não é encontrada, a menos que o cromossomo seja cortado; a superhélice é a forma geralmente encontrada na natureza.
Para fins de cálculos matemáticos, uma superhélice destra é definida como tendo um número "negativo" de voltas superhélicas, e uma superhélice canhota é definida como tendo um número "positivo" de voltas superhélicas. No desenho (mostrado à direita), tanto o enrolamento secundário ( ou seja, "Watson-Crick") e o enrolamento terciário ( ou seja, "superhelical") são destros, portanto, as supertwists são negativas (–3 neste exemplo )
Supõe-se que a superelicidade seja o resultado do enrolamento inferior, o que significa que há uma deficiência no número de torções Watson-Crick secundárias. Esse cromossomo será tensionado, assim como uma mola de metal macroscópica é tensionada quando é enrolada ou desenrolada. No DNA que é assim tenso, aparecerão supertwists.
O superenrolamento do DNA pode ser descrito numericamente por mudanças no número de ligação Lk . O número de ligação é a propriedade mais descritiva do DNA superenrolado. Lk o , o número de voltas no plasmídeo / molécula de DNA relaxado (tipo B), é determinado dividindo o total de pares de bases da molécula pelo bp relaxado / volta que, dependendo da referência é 10,4; 10,5; 10,6.
Lk é o número de cruzamentos que uma única fita faz na outra, geralmente visualizada como o número de torções Watson-Crick encontradas em um cromossomo circular em uma projeção plana (geralmente imaginária). Esse número é fisicamente "travado" no momento do fechamento covalente do cromossomo e não pode ser alterado sem a quebra do fio.
A topologia do DNA é descrita pela equação abaixo na qual o número de ligação é equivalente à soma de Tw , que é o número de voltas ou voltas da dupla hélice, e Wr , que é o número de espirais ou "contorções". " Se houver uma molécula de DNA fechada, a soma de Tw e Wr , ou o número de ligação, não muda. No entanto, pode haver alterações complementares em Tw e Wr sem alterar sua soma:
Tw , chamado de "torção", é o número de torções Watson-Crick no cromossomo quando ele não está restrito a ficar em um plano. Já vimos que o DNA nativo costuma ser superélico. Se alguém contornar o cromossomo superelicamente torcido, contando as torções secundárias de Watson-Crick, esse número será diferente do número contado quando o cromossomo é restrito a permanecer plano. Em geral, espera-se que o número de torções secundárias no cromossomo nativo super torcido seja o número de enrolamento Watson-Crick "normal", significando uma única torção helicoidal de 10 pares de bases para cada 34 Å de comprimento de DNA.
Wr , denominado "contorcer-se", é o número de torções superhélicas. Uma vez que o DNA circular biológico é geralmente subwound, Lk geralmente será menor do que Tw , o que significa que Wr será tipicamente negativo.
Se o DNA estiver sob tensão, ele estará sob tensão, exatamente como uma mola de metal é esticada quando desenrolada com força, e que o aparecimento de supertwists permitirá que o cromossomo alivie sua tensão assumindo supertwists negativas, que corrigem o underwinding secundário de acordo com a equação da topologia acima.
A equação da topologia mostra que há uma relação um-para-um entre as mudanças em Tw e Wr . Por exemplo, se uma torção secundária "Watson-Crick" for removida, uma supertwist destra deve ter sido removida simultaneamente (ou, se o cromossomo estiver relaxado, sem supertwist, então uma supertwist canhota deve ser adicionada).
A mudança no número de ligação, Δ Lk , é o número real de voltas no plasmídeo / molécula, Lk , menos o número de voltas no plasmídeo / molécula relaxada Lk o :
Se o DNA for superenrolado negativamente ,. O superenrolamento negativo implica que o DNA está subenrolado.
Uma expressão padrão independente do tamanho da molécula é a "diferença de ligação específica" ou "densidade super-helicoidal" denotada por σ , que representa o número de voltas adicionadas ou removidas em relação ao número total de voltas na molécula / plasmídeo relaxado, indicando o nível de superenrolamento.
A energia livre de Gibbs associada ao enrolamento é dada pela equação abaixo
A diferença na energia livre de Gibbs entre o DNA circular superenrolado e o DNA circular desenrolado com N > 2.000 bp é aproximada por:
ou 16 cal / bp.
Uma vez que o número de ligação L do DNA superenrolado é o número de vezes que as duas fitas estão entrelaçadas (e ambas as fitas permanecem covalentemente intactas), L não pode mudar. O estado de referência (ou parâmetro) L 0 de um duplex de DNA circular é seu estado relaxado. Neste estado, a contorcer-se W = 0. Uma vez que L = T + W , num estado relaxado T = L . Assim, se tivermos um duplex de DNA circular relaxado de 400 bp, L ~ 40 (assumindo ~ 10 bp por volta no B-DNA). Em seguida, T ~ 40 .
- Superenrolando positivamente:
- T = 0, W = 0, então L = 0
- T = +3, W = 0, então L = +3
- T = +2, W = +1, então L = +3
- Superenrolamento negativo:
- T = 0, W = 0, então L = 0
- T = -3, W = 0, então L = -3
- T = -2, W = -1, então L = -3
Supercoils negativos favorecem o desenrolamento local do DNA, permitindo processos como a transcrição , replicação do DNA e recombinação . Supõe-se que o superenrolamento negativo também favorece a transição entre o B-DNA e o Z-DNA , e modera as interações das proteínas de ligação ao DNA envolvidas na regulação gênica .
Modelos estocásticos
Alguns modelos estocásticos foram propostos para explicar os efeitos do acúmulo de superenrolamento positivo (PSB) na dinâmica da expressão gênica (por exemplo, na expressão de genes bacterianos), diferindo, por exemplo, no nível de detalhe. Em geral, os detalhes aumentam ao adicionar processos afetados e afetando o superenrolamento. Conforme essa adição ocorre, a complexidade do modelo aumenta.
Por exemplo, em dois modelos de complexidade diferente são propostos. No mais detalhado, os eventos foram modelados no nível de nucleotídeo, enquanto no outro os eventos foram modelados apenas na região do promotor e, portanto, exigiram que muito menos eventos fossem contabilizados.
Exemplos de modelos estocásticos que enfocam os efeitos do PSB na atividade de um promotor podem ser encontrados em:. Em geral, tais modelos incluem um promotor, Pro, que é a região do DNA que controla a transcrição e, portanto, cuja atividade / bloqueio é afetada pelo PSB. Também estão incluídas moléculas de RNA (o produto da transcrição), RNA polimerases (RNAP) que controlam a transcrição e girases (G) que regulam o PSB. Finalmente, deve haver um meio de quantificar o PSB no DNA (ou seja, o promotor) em qualquer momento. Isso pode ser feito tendo algum componente no sistema que é produzido ao longo do tempo (por exemplo, durante eventos de transcrição) para representar superenrolamentos positivos, e que é removido pela ação das giroses. A quantidade desse componente pode então ser definida para afetar a taxa de transcrição.
Efeitos no coeficiente de sedimentação
As propriedades topológicas do DNA circular são complexas. Em textos padrão, essas propriedades são invariavelmente explicadas em termos de um modelo helicoidal para DNA, mas em 2008 foi notado que cada topoisômero, negativo ou positivo, adota uma distribuição única e surpreendentemente ampla de conformações tridimensionais.
Quando o coeficiente de sedimentação, s , do DNA circular é verificado em uma grande faixa de pH , as seguintes curvas são vistas. Três curvas são mostradas aqui, representando três espécies de DNA. De cima para baixo, eles são: "Formulário IV" (verde), "Formulário I" (azul) e "Formulário II" (vermelho).
"Forma I" (curva azul) é a nomenclatura tradicional usada para a forma nativa do DNA circular duplex, recuperado de vírus e plasmídeos intracelulares. A Forma I é covalentemente fechada, e qualquer enrolamento plectonêmico que possa estar presente é, portanto, travado. Se um ou mais cortes são introduzidos na Forma I, a rotação livre de uma fita em relação à outra torna-se possível, e a Forma II (curva vermelha) é visto.
A Forma IV (curva verde) é o produto da desnaturação alcalina da Forma I. Sua estrutura é desconhecida, exceto que é persistentemente duplex e extremamente densa.
Entre pH 7 e pH 11,5, o coeficiente de sedimentação s , para a Forma I, é constante. Em seguida, ele cai e, em um pH logo abaixo de 12, atinge o mínimo. Com aumentos adicionais no pH, s então retorna ao seu valor anterior. Ele não para por aí, porém, continua a aumentar implacavelmente. Por pH 13, o valor de s aumentou para quase 50, duas a três vezes seu valor em pH 7, indicando uma estrutura extremamente compacta.
Se o pH for reduzido, o valor s não será restaurado. Em vez disso, vê-se a curva verde superior. O DNA, agora no estado conhecido como Forma IV, permanece extremamente denso, mesmo se o pH for restaurado à faixa fisiológica original. Como afirmado anteriormente, a estrutura do Formulário IV é quase totalmente desconhecida e não há nenhuma explicação aceita atualmente para sua densidade extraordinária. Tudo o que se sabe sobre a estrutura terciária é que ela é duplex, mas não possui ligações de hidrogênio entre as bases.
Esses comportamentos das Formas I e IV são considerados devidos às propriedades peculiares do DNA duplex, que foi covalentemente fechado em um círculo de fita dupla. Se a integridade covalente for interrompida por até mesmo um único corte em uma das fitas, todo esse comportamento topológico cessa e pode-se ver a curva inferior da Forma II (Δ). Para a Forma II, as alterações no pH têm muito pouco efeito sobre a s . Suas propriedades físicas são, em geral, idênticas às do DNA linear. Em pH 13, as fitas da Forma II simplesmente se separam, assim como as fitas do DNA linear. As fitas individuais separadas têm valores de s ligeiramente diferentes , mas não exibem mudanças significativas em s com aumentos adicionais no pH.
Uma explicação completa para esses dados está além do escopo deste artigo. Em resumo, as alterações em s ocorrem devido a mudanças na superelicidade do DNA circular. Essas mudanças na superelicidade são ilustradas esquematicamente por quatro pequenos desenhos que foram estrategicamente sobrepostos à figura acima.
Resumidamente, as alterações de s vistas na curva de titulação de pH acima são amplamente consideradas como sendo devidas a mudanças no enrolamento superélico do DNA sob condições de aumento do pH. Até pH 11,5, o suposto "enrolamento" produz uma supertorsão destra ("negativa"). Mas à medida que o pH aumenta e a estrutura helicoidal secundária começa a desnaturar e se desenrolar, o cromossomo (se podemos falar antropomorficamente) não "quer" mais ter o enrolamento Watson-Crick completo, mas sim "quer", cada vez mais, ser "underwound". Uma vez que há cada vez menos tensão a ser aliviada pelo enrolamento super-helicoidal, as super-helices, portanto, desaparecem progressivamente à medida que o pH aumenta. Em um pH logo abaixo de 12, todos os incentivos para a superelicidade expiraram, e o cromossomo aparecerá como um círculo aberto e relaxado.
Com um pH ainda mais alto, o cromossomo, que agora está se desnaturando para valer, tende a se desenrolar totalmente, o que não é possível (porque L k está covalentemente travado). Nessas condições, o que antes era tratado como "enrolamento" agora se tornou "enrolamento excessivo". Mais uma vez há tensão, e mais uma vez (pelo menos em parte) aliviada pela superelicidade, mas desta vez na direção oposta ( isto é, canhoto ou "positivo"). Cada supertorção terciária canhota remove uma única e indesejável torção secundária de Watson-Crick para a mão direita.
A titulação termina em pH 13, onde aparece a Forma IV.
Veja também
Referências
Referências gerais
- Bloomfield, Victor A .; Crothers, Donald M .; Tinoco, Jr., Ignacio (2000). Ácidos nucleicos: estruturas, propriedades e funções . Sausalito, Califórnia: University Science Books. pp. 446–453. ISBN 978-0935702491.