Complexo de pré-replicação - Pre-replication complex
Um complexo de pré-replicação ( pré-RC ) é um complexo de proteína que se forma na origem da replicação durante a etapa de iniciação da replicação do DNA . A formação do pré-RC é necessária para que ocorra a replicação do DNA. A replicação completa e fiel do genoma garante que cada célula filha carregue a mesma informação genética que a célula-mãe. Consequentemente, a formação do pré-RC é uma parte muito importante do ciclo celular .
Componentes
Conforme os organismos evoluíram e se tornaram cada vez mais complexos, o mesmo aconteceu com seus pré-RCs. A seguir está um resumo dos componentes do pré-RC entre os diferentes domínios da vida.
Nas bactérias , o principal componente do pré-RC é o DnaA . O pré-RC está completo quando o DnaA ocupa todos os seus locais de ligação dentro da origem de replicação bacteriana ( oriC ).
O pré-RC archaeal é muito diferente do pré-RC bacteriano e pode servir como um modelo simplificado do pré-RC eucariótico. É composto por uma proteína do complexo de reconhecimento de origem única (ORC), Cdc6 / ORC1 , e um homohexâmero da proteína de manutenção do minicromossomo (MCM). Sulfolobus islandicus também usa um homólogo Cdt1 para reconhecer uma de suas origens de replicação.
O pré-RC eucariótico é o pré-RC mais complexo e altamente regulado. Na maioria dos eucariotos, é composto por seis proteínas ORC (ORC1-6), Cdc6 , Cdt1 e um heterohexâmero das seis proteínas MCM (MCM2-7). O heterohexâmero MCM indiscutivelmente surgiu através de eventos de duplicação do gene MCM e subsequente evolução divergente. O pré-RC de Schizosaccharomyces pombe ( S. pombe ) é notavelmente diferente daquele de outros eucariotos; O Cdc6 é substituído pela proteína Cdc18 homóloga. Sap1 também está incluído no S. pombe pré-RC porque é necessário para a ligação de Cdc18. O pré-RC de Xenopus laevis ( X. laevis ) também possui uma proteína adicional, MCM9, que ajuda a carregar o heterohexâmero MCM na origem de replicação. A estrutura do ORC, MCM, bem como do complexo intermediário ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7 (OCCM) foi resolvida.
Reconhecimento da origem de replicação
O reconhecimento da origem da replicação é um primeiro passo crítico na formação do pré-RC. Em diferentes domínios da vida, esse processo é realizado de maneira diferente.
Em procariontes, o reconhecimento da origem é realizado pelo DnaA. DnaA liga-se fortemente a uma sequência de consenso de 9 pares de bases em OriC; 5 '- TTATCCACA - 3'. Existem 5 dessas sequências de 9 pb (R1-R5) e 4 sequências não consensuais (I1-I4) dentro de oriC que DnaA se liga com afinidade diferencial. DnaA se liga a R4, R1 e R2 com alta afinidade e R5, I1, I2, I3 e R3 com menor afinidade. O pré-RC está completo quando o DnaA ocupa todos os locais de ligação de 9 bp de alta e baixa afinidade.
Archaea tem 1–3 origens de replicação. As origens são geralmente tratos ricos em AT que variam de acordo com as espécies de archaeal. A proteína ORC archaeal singular reconhece os tratos ricos em AT e se liga ao DNA de uma forma dependente de ATP.
Os eucariotos normalmente têm várias origens de replicação; pelo menos um por cromossomo. Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) é o único eucariota conhecido com uma sequência de iniciação definida TTTTTATG / ATTTA / T. Esta sequência de iniciação é reconhecida por ORC1-5. O ORC6 não é conhecido por se ligar ao DNA em S. cerevisiae . As sequências de iniciação em S. pombe e eucariotos superiores não estão bem definidas. No entanto, as sequências de iniciação são geralmente ricas em AT ou apresentam topologia de DNA dobrada ou curvada. A proteína ORC4 é conhecida por se ligar à porção rica em AT da origem de replicação em S. pombe usando motivos em gancho AT. O mecanismo de reconhecimento de origem em eucariotos superiores não é bem compreendido, mas acredita-se que as proteínas ORC1-6 dependem de topologia incomum de DNA para a ligação.
Carregando
A montagem do complexo de pré-replicação ocorre apenas durante a fase M tardia e a fase G1 inicial do ciclo celular, quando a atividade da quinase dependente da ciclina (CDK) é baixa. Este tempo e outros mecanismos regulatórios garantem que a replicação do DNA ocorrerá apenas uma vez por ciclo celular. A montagem do pré-RC depende do reconhecimento prévio da origem, seja por DnaA em procariontes ou por ORC em arquéias e eucariotos.
O pré-RC dos procariotos está completo quando o DnaA ocupa todos os locais de ligação possíveis dentro do oriC.
O pré-RC de archaea requer ligação ORC da origem. Depois disso, o Cdc6 e o complexo homohexamérico MCM ligam-se de forma sequencial.
Os eucariotos têm o pré-RC mais complexo. Depois que o ORC1-6 se liga à origem de replicação, o Cdc6 é recrutado. Cdc6 recruta o fator de licenciamento Cdt1 e MCM2-7. A ligação do Cdt1 e a hidrólise do ATP pela ORC e o Cdc6 carregam MCM2-7 no DNA. Há um excesso estequiométrico das proteínas MCM sobre as proteínas ORC e Cdc6, indicando que pode haver vários heterohexâmeros MCM ligados a cada origem de replicação.
Iniciação de replicação
Depois que o pré-RC é formado, ele deve ser ativado e o replissoma montado para que a replicação do DNA ocorra.
Em procariotos, o DnaA hidrolisa o ATP para desenrolar o DNA no oriC. Esta região desnaturada é acessível ao DnaB helicase e ao carregador de DnaC helicase. As proteínas de ligação de fita única estabilizam a bolha de replicação recém-formada e interagem com a DnaG primase . O DnaG recruta a DNA polimerase III replicativa e a replicação começa.
Em eucariotos, o heterohexâmero MCM é fosforilado por CDC7 e CDK, que desloca Cdc6 e recruta MCM10 . MCM10 coopera com MCM2-7 no recrutamento de Cdc45 . Cdc45 então recruta componentes-chave do replissome ; a DNA polimerase replicativa α e sua primase. A replicação do DNA pode então começar.
Prevenção de remontagem complexa de pré-replicação
Durante cada ciclo celular, é importante que o genoma seja completamente replicado uma vez e apenas uma vez. A formação do complexo de pré-replicação durante o final da fase M e início da fase G1 é necessária para a replicação do genoma, mas após o genoma ter sido replicado, o pré-RC não deve se formar novamente até o próximo ciclo celular. Em S. cerevisiae, os CDKs evitam a formação do complexo de replicação durante as fases G1, S e G2 tardias, excluindo MCM2-7 e Cdt1 do núcleo, direcionando o Cdc6 para degradação pelo proteassoma e dissociando ORC1-6 da cromatina por meio de fosforilação . A prevenção da replicação em S. pombe é ligeiramente diferente; O Cdt1 é degradado pelo proteassoma em vez de ser meramente excluído do núcleo. A regulação proteolítica de Cdt1 é compartilhada por eucariotos superiores, incluindo Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , X. laevis e mamíferos . Os metazoários têm um quarto mecanismo para evitar a replicação ; durante S e G2, a geminina se liga a Cdt1 e inibe Cdt1 de carregar MCM2-7 na origem de replicação.
Síndrome de Meier-Gorlin
Defeitos nos componentes do complexo de replicação eucariótica são conhecidos por causar síndrome de Gorlin-Meier , que é caracterizada por nanismo , ausente ou hipoplasia patelas , as pequenas orelhas, auditivos crescimento pré- e pós-natal, e microcefalia . As mutações conhecidas estão nos genes ORC1 , ORC4 , ORC6 , CDT1 e CDC6 . O fenótipo da doença provavelmente se origina da capacidade reduzida das células de proliferar , levando ao número de células e falha geral do crescimento.