Morfolino - Morpholino

Segmento de um heteroduplex Morfolino-RNA, 8-mer mostrado

Um morfolino , também conhecido como oligômero de morfolino e como oligômero de morfolino fosforodiamidato (PMO), é um tipo de molécula de oligômero (coloquialmente, um oligo ) usado em biologia molecular para modificar a expressão gênica . Sua estrutura molecular contém bases de DNA ligadas a uma espinha dorsal de anéis de metilenemorfolina ligados por meio de grupos fosforodiamidato . Os morfolinos bloqueiam o acesso de outras moléculas a pequenas sequências específicas (~ 25 bases) das superfícies de emparelhamento de bases do ácido ribonucleico (RNA). Os morfolinos são usados ​​como ferramentas de pesquisa para a genética reversa , derrubando a função do gene.

Este artigo discute apenas os oligômeros antisense Morpholino, que são análogos de ácido nucleico . A palavra "Morfolino" pode ocorrer em outros nomes químicos, referindo-se a produtos químicos que contêm um anel de morfolina de seis membros . Para ajudar a evitar confusão com outras moléculas que contêm morfolina, ao descrever oligos, "Morpholino" é frequentemente capitalizado como um nome comercial , mas esse uso não é consistente na literatura científica. Os oligos morfolino são algumas vezes referidos como PMO (para o oligômero morfolino fosforodiamidato), especialmente na literatura médica. Vivo-Morpholinos e PPMO são formas modificadas de Morpholinos com grupos químicos ligados covalentemente para facilitar a entrada nas células.

O knockdown do gene é conseguido reduzindo a expressão de um determinado gene em uma célula. No caso de genes que codificam proteínas, isso geralmente leva a uma redução na quantidade da proteína correspondente na célula. Derrubar a expressão gênica é um método para aprender sobre a função de uma proteína específica; de maneira semelhante, fazer com que um exon específico seja spliced ​​fora do transcrito de RNA que codifica uma proteína pode ajudar a determinar a função da porção da proteína codificada por esse exon ou às vezes pode derrubar a atividade da proteína por completo. Essas moléculas foram aplicadas a estudos em vários organismos-modelo , incluindo camundongos , peixes-zebra , rãs e ouriços-do-mar . Os morfolinos também podem modificar o splicing do pré-mRNA ou inibir a maturação e a atividade do miRNA. Técnicas para direcionar Morpholinos a RNAs e entregar Morpholinos em células foram recentemente revisadas em um artigo de jornal e na forma de livro.

Os morfolinos estão em desenvolvimento como terapêutica farmacêutica direcionada contra organismos patogênicos , como bactérias ou vírus, e doenças genéticas . Um medicamento à base de morfolino eteplirsen da Sarepta Therapeutics recebeu aprovação acelerada da Food and Drug Administration dos EUA em setembro de 2016 para o tratamento de algumas mutações que causam distrofia muscular de Duchenne , embora o processo de aprovação tenha sido cercado de controvérsia. Outro golodirsen baseado em morfolino (também para distrofia muscular de Duchenne) foi aprovado pelo FDA em dezembro de 2019.

História

Morpholino oligos foram concebidos por Summerton ( Gene Tools ) na AntiVirals Inc. (agora Sarepta Therapeutics) e originalmente desenvolvidos em colaboração com Weller.

Estrutura

Morfolinos são moléculas sintéticas que são o produto de um redesenho da estrutura natural do ácido nucléico . Normalmente com 25 bases de comprimento, eles se ligam a sequências complementares de RNA ou DNA de fita simples por emparelhamento de bases de ácido nucleico padrão . Em termos de estrutura, a diferença entre os morfolinos e o DNA é que, enquanto os morfolinos têm bases de ácido nucléico padrão, essas bases estão ligadas a anéis de metileno morfolina ligados por meio de grupos fosforodiamidato em vez de fosfatos . A figura compara as estruturas das duas fitas aqui representadas, uma de RNA e outra de Morfolino. A substituição de fosfatos aniônicos pelos grupos fosforodiamidato sem carga elimina a ionização na faixa de pH fisiológica usual , de modo que os morfolinos em organismos ou células são moléculas sem carga. Todo o backbone de um Morpholino é feito dessas subunidades modificadas.

Função

Os morfolinos não provocam a degradação de suas moléculas de RNA alvo, ao contrário de muitos tipos estruturais antisense (por exemplo, fosforotioatos , siRNA ). Em vez disso, os morfolinos agem por "bloqueio estérico", ligando-se a uma sequência alvo dentro de um RNA, inibindo moléculas que poderiam interagir com o RNA. Morfolino oligos são freqüentemente usados ​​para investigar o papel de um transcrito de mRNA específico em um embrião . Biólogos desenvolvimentistas injetam oligos Morpholino em ovos ou embriões de peixe-zebra , sapo africano com garras ( Xenopus ), ouriço-do-mar e killifish ( F. heteroclitus ) que produzem embriões morfantes , ou morfolinos eletroporados em embriões de galinha em estágios posteriores de desenvolvimento. Com sistemas de entrega citosólica apropriados, os morfolinos são eficazes na cultura de células . Os vivo-morfolinos, nos quais o oligo está covalentemente ligado a um dendrímero de entrega , entram nas células quando administrados sistemicamente em animais adultos ou em culturas de tecidos.

Expressão gênica normal em eucariotos

Expressão de genes eucarióticos sem intervenção de um Morfolino

Em organismos eucarióticos , o pré-mRNA é transcrito no núcleo, os íntrons são separados e o mRNA maduro é exportado do núcleo para o citoplasma . A pequena subunidade do ribossomo geralmente começa ligando-se na extremidade 5 'do mRNA e é unida por vários outros fatores de iniciação eucarióticos , formando o complexo de iniciação. O complexo de iniciação faz a varredura ao longo da fita de mRNA até atingir um códon de início e, em seguida, a grande subunidade do ribossomo se liga à pequena subunidade e a tradução de uma proteína começa. Todo esse processo é conhecido como expressão gênica; é o processo pelo qual a informação em um gene , codificada como uma sequência de bases no DNA , é convertida na estrutura de uma proteína. Um Morpholino pode modificar o splicing, bloquear a tradução ou bloquear outros locais funcionais no RNA, dependendo da sequência de base do Morpholino.

Bloqueando a tradução

Tradução bloqueada por um oligo Morpholino

Ligado à região 5 'não traduzida do RNA mensageiro (mRNA), os morfolinos podem interferir com a progressão do complexo de iniciação ribossômica da capa 5' para o códon de início. Isso evita a tradução da região codificadora do transcrito direcionado (chamado de expressão do gene " knocking down " ). Isso é útil experimentalmente quando um investigador deseja saber a função de uma proteína específica; Os morfolinos fornecem um meio conveniente de inibir a expressão da proteína e aprender como essa eliminação altera as células ou o organismo. Alguns Morpholinos reduzem a expressão de forma tão eficaz que, após a degradação de proteínas preexistentes, as proteínas-alvo tornam-se indetectáveis ​​por Western blot .

Em 2016, descobriu-se que um PMO conjugado a peptídeo sintético (PPMO) inibia a expressão de New Delhi Metallo-beta-lactamase , uma enzima que muitas bactérias resistentes a medicamentos usam para destruir carbapenêmicos.

Modificando o splicing pré-mRNA

Splicing bloqueado por um oligo Morpholino

Os morfolinos podem interferir com as etapas de processamento do pré-mRNA impedindo que complexos de ribonucleoproteínas nucleares ( snRNP ) se liguem a seus alvos nas bordas dos íntrons em uma fita de pré-mRNA ou bloqueando a base de adenina nucleofílica e evitando-a de formar a estrutura do lariat de splice, ou interferir com a ligação de proteínas reguladoras de splice, como silenciadores de splice e intensificadores de splice . A prevenção da ligação de snRNP U1 (no local doador) ou U2 / U5 (na porção polipirimidina e local aceitador) pode causar splicing modificado , geralmente excluindo exons do mRNA maduro. A segmentação de alguns alvos de emenda resulta em inclusões de íntrons, enquanto a ativação de locais de emenda crípticos pode levar a inclusões ou exclusões parciais. Os alvos dos snRNPs U11 / U12 também podem ser bloqueados. A modificação de emenda pode ser convenientemente testada por reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa ( RT-PCR ) e é vista como um deslocamento de banda após a eletroforese em gel de produtos de RT-PCR.

Outras aplicações: bloqueio de outros sites de mRNA e uso como sondas

Morfolinos têm sido usados ​​para bloquear a atividade e maturação de miRNA . Fluoresceína tagged Morpholinos combinados com anticorpos específicos com fluoresceína pode ser usado como sondas para hibridação in-situ para miARNs. Os morfolinos podem bloquear a atividade da ribozima . As funções U2 e U12 snRNP foram inibidas por Morpholinos. Morfolinos direcionados a sequências "escorregadias" de mRNA dentro de regiões de codificação de proteínas podem induzir mudanças de quadro de tradução . Os morfolinos podem bloquear a edição de RNA, a cauda poli-A e as sequências de translocação. As atividades de morfolino contra essa variedade de alvos sugerem que os morfolinos podem ser usados ​​como uma ferramenta de propósito geral para bloquear interações de proteínas ou ácidos nucléicos com mRNA.

Especificidade, estabilidade e efeitos não antisense

Os morfolinos se tornaram uma ferramenta de knockdown padrão em sistemas embrionários animais , que têm uma gama mais ampla de expressão gênica do que as células adultas e podem ser fortemente afetados por uma interação fora do alvo. Após as injeções iniciais em embriões de rã ou peixe nos estágios de célula única ou de poucas células, os efeitos do Morfolino podem ser medidos até cinco dias depois, após a maioria dos processos de organogênese e diferenciação terem passado, com fenótipos observados consistentes com o gene-alvo derrubar. Os oligos de controle com sequências irrelevantes geralmente não produzem nenhuma alteração no fenótipo embrionário, evidência da especificidade da sequência do Morfolino oligo e falta de efeitos não antisense. A dose necessária para um knockdown pode ser reduzida por co-injeção de vários Morpholino oligos visando o mesmo mRNA, que é uma estratégia eficaz para reduzir ou eliminar interações de RNA fora do alvo dependentes da dose.

Os experimentos de resgate de mRNA às vezes podem restaurar o fenótipo do tipo selvagem para os embriões e fornecer evidências para a especificidade de um Morfolino. Em um resgate de mRNA, um Morpholino é co-injetado com um mRNA que codifica a proteína do morfolino. No entanto, o mRNA de resgate tem uma 5'-UTR modificada (região não traduzida) de modo que o mRNA de resgate não contém nenhum alvo para o Morpholino. A região codificadora do mRNA de resgate codifica a proteína de interesse. A tradução do mRNA de resgate substitui a produção da proteína que foi derrubada pelo Morpholino. Uma vez que o mRNA de resgate não afetaria as alterações fenotípicas devido à modulação da expressão do gene fora do alvo do Morpholino, esse retorno ao fenótipo de tipo selvagem é mais uma evidência da especificidade do Morpholino. Em alguns casos, a expressão ectópica do RNA de resgate torna a recuperação do fenótipo de tipo selvagem impossível.

Em embriões, os morfolinos podem ser testados em mutantes nulos para verificar se há interações inesperadas de RNA e, em seguida, usados ​​em um embrião de tipo selvagem para revelar o fenótipo de knockdown agudo. O fenótipo knockdown é frequentemente mais extremo do que o fenótipo mutante; no mutante, os efeitos da perda do gene nulo podem ser ocultados pela compensação genética.

Por causa de seus backbones completamente não naturais, os morfolinos não são reconhecidos pelas proteínas celulares. Nucleases não degradam Morfolinos, nem são degradados no soro ou nas células.

Até 18% dos Morpholinos parecem induzir fenótipos não relacionados ao alvo, incluindo morte celular no sistema nervoso central e tecidos somitos de embriões de peixe-zebra. A maioria desses efeitos são devidos à ativação da apoptose mediada por p53 e podem ser suprimidos por co-injeção de um Morfolino anti-p53 junto com o Morfolino experimental. Além disso, o efeito apoptótico mediado por p53 de um knockdown de Morpholino foi fenocopiado usando outro tipo estrutural antisense, mostrando que a apoptose mediada por p53 é uma consequência da perda da proteína alvo e não uma consequência do tipo de oligo knockdown. Parece que esses efeitos são específicos da sequência; como na maioria dos casos, se um Morpholino estiver associado a efeitos não-alvo, o Morpholino incompatível de 4 bases não acionará esses efeitos.

Um motivo de preocupação no uso de Morpholinos é o potencial de efeitos "fora do alvo". Se um fenótipo morphant observado é devido ao knockdown pretendido ou uma interação com um RNA fora do alvo, muitas vezes pode ser abordado em embriões executando outro experimento para confirmar que o fenótipo morphant observado resulta do knockdown do alvo esperado. Isso pode ser feito recapitulando o fenótipo morphant com um segundo Morfolino não sobreposto visando o mesmo mRNA, pela confirmação dos fenótipos observados por comparação com uma cepa mutante (embora a compensação obscureça um fenótipo em alguns mutantes), testando o Morfolino em um fundo mutante nulo para detectar alterações fenotípicas adicionais ou por métodos negativos dominantes. Como mencionado acima, o resgate de fenótipos observados por co-injeção de um mRNA de resgate é, quando viável, um teste confiável de especificidade de um Morpholino.

Entrega

Para que um Morfolino seja eficaz, ele deve ser entregue através da membrana celular no citosol de uma célula. Uma vez no citosol, os Morpholinos se difundem livremente entre o citosol e o núcleo, conforme demonstrado pela atividade modificadora de splice nuclear dos Morpholinos observada após a microinjeção no citosol das células. Diferentes métodos são usados ​​para entrega em embriões, em células cultivadas ou em animais adultos. Um aparelho de microinjeção é geralmente usado para entrega em um embrião, com as injeções mais comumente realizadas no estágio de uma única célula ou de poucas células; um método alternativo para entrega embrionária é a eletroporação , que pode entregar oligos em tecidos de estágios embrionários posteriores. As técnicas comuns para entrega em células cultivadas incluem o peptídeo Endo-Porter (que faz com que o Morfolino seja liberado dos endossomos ), o sistema de entrega especial (não mais disponível comercialmente, usou um heteroduplex de Morfolino-DNA e um reagente de entrega de polietilenimina etoxilado ), eletroporação , ou raspe o carregamento.

A entrega aos tecidos adultos é geralmente difícil, embora existam alguns sistemas que permitem a captação útil de oligos Morfolino não modificados (incluindo a captação nas células musculares com distrofia muscular de Duchenne ou nas células endoteliais vasculares estressadas durante a angioplastia com balão ). Embora eles permeiem através dos espaços intercelulares nos tecidos de forma eficaz, os PMOs não conjugados têm distribuição limitada no citosol e nos espaços nucleares nos tecidos saudáveis ​​após a administração IV. A entrega sistêmica em muitas células em organismos adultos pode ser realizada usando conjugados covalentes de Morpholino oligos com peptídeos de penetração celular e, embora a toxicidade tenha sido associada a doses moderadas dos conjugados de peptídeo, eles foram usados in vivo para entrega eficaz de oligo em doses inferiores às que causam a toxicidade observada. Um dendrímero de octa-guanidínio ligado à extremidade de um Morfolino pode entregar o oligo modificado (chamado Vivo-Morfolino) do sangue para o citosol. Morfolinos habilitados para entrega, como conjugados de peptídeos e Vivo-Morpholinos, mostram-se promissores como terapêuticos para doenças virais e genéticas.

Veja também

• Síntese de oligonucleotídeos
• Análogo de ácido nucléico

Referências

Leitura adicional