Diidrofolato redutase - Dihydrofolate reductase
Diidrofolato redutase | |||||||||
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Identificadores | |||||||||
EC nº | 1.5.1.3 | ||||||||
CAS no. | 9002-03-3 | ||||||||
Bancos de dados | |||||||||
IntEnz | Vista IntEnz | ||||||||
BRENDA | Entrada BRENDA | ||||||||
ExPASy | NiceZyme view | ||||||||
KEGG | Entrada KEGG | ||||||||
MetaCyc | via metabólica | ||||||||
PRIAM | perfil | ||||||||
Estruturas PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
Ontologia Genética | AmiGO / QuickGO | ||||||||
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Diidrofolato redutase | |||||||||
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Identificadores | |||||||||
Símbolo | DHFR_1 | ||||||||
Pfam | PF00186 | ||||||||
Clã Pfam | CL0387 | ||||||||
InterPro | IPR001796 | ||||||||
PRÓSITO | PDOC00072 | ||||||||
SCOP2 | 1dhi / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
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R67 dihidrofolato redutase | |||||||||
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Identificadores | |||||||||
Símbolo | DHFR_2 | ||||||||
Pfam | PF06442 | ||||||||
InterPro | IPR009159 | ||||||||
SCOP2 | 1vif / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
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Redutase de di-hidrofolato , ou DHFR , é uma enzima que reduz o ácido diidrofólico de ácido tetra-hidrofólico , utilizando NADPH como doador de electrões , que podem ser convertidos para os tipos de tetrahidrofolato cofactores utilizados na química de transferência de um carbono. Em humanos, a enzima DHFR é codificada pelo gene DHFR . É encontrado na região q11 → q22 do cromossomo 5. As espécies bacterianas possuem enzimas DHFR distintas (com base em seu padrão de ligação de moléculas diaminoheterocíclicas ), mas os DHFRs de mamíferos são altamente semelhantes.
Estrutura
Uma folha beta pregueada de oito fitas central constitui a principal característica do dobramento da espinha dorsal do polipeptídeo de DHFR. Sete dessas fitas são paralelas e a oitava é antiparalela. Quatro hélices alfa conectam cadeias beta sucessivas. Os resíduos 9 - 24 são denominados "Met20" ou "loop 1" e, juntamente com outros loops, fazem parte do subdomínio principal que circunda o site ativo . O sítio ativo está situado na metade N-terminal da sequência, que inclui um dipeptídeo Pro - Trp conservado ; o triptofano demonstrou estar envolvido na ligação do substrato pela enzima.
Função
A di-hidrofolato redutase converte o di - hidrofolato em tetra- hidrofolato , uma lançadeira de prótons necessária para a síntese de novo de purinas , ácido timidílico e certos aminoácidos . Embora o gene da diidrofolato redutase funcional tenha sido mapeado no cromossomo 5, vários pseudogenes processados sem intron ou genes semelhantes à diidrofolato redutase foram identificados em cromossomos separados.
Encontrado em todos os organismos, o DHFR tem um papel crítico na regulação da quantidade de tetrahidrofolato na célula. O tetrahidrofolato e seus derivados são essenciais para a síntese de purinas e timidilatos , importantes para a proliferação e crescimento celular. DHFR desempenha um papel central na síntese de precursores de ácido nucléico , e foi demonstrado que as células mutantes que carecem completamente de DHFR requerem glicina, um aminoácido e timidina para crescer. O DHFR também foi demonstrado como uma enzima envolvida na recuperação da tetraidrobiopterina da diidrobiopterina
Mecanismo
Mecanismo geral
DHFR catalisa a transferência de um hidreto de NADPH para di - hidrofolato com uma protonação de acompanhamento para produzir tetra-hidrofolato . No final, o diidrofolato é reduzido a tetraidrofolato e o NADPH é oxidado a NADP + . A alta flexibilidade do Met20 e outros loops próximos ao sítio ativo desempenham um papel na promoção da liberação do produto, o tetrahidrofolato. Em particular, a alça Met20 ajuda a estabilizar o anel de nicotinamida do NADPH para promover a transferência do hidreto do NADPH para o diidrofolato.
O mecanismo desta enzima é gradual e aleatório em estado estacionário. Especificamente, a reação catalítica começa com o NADPH e o substrato ligando-se ao sítio de ligação da enzima, seguido pela protonação e transferência de hidreto do cofator NADPH para o substrato. No entanto, as duas últimas etapas não ocorrem simultaneamente em um mesmo estado de transição. Em um estudo usando abordagens computacionais e experimentais, Liu et al concluem que a etapa de protonação precede a transferência de hidreto.
O mecanismo enzimático de DHFR mostra-se dependente do pH, particularmente a etapa de transferência de hidreto, uma vez que as mudanças de pH têm uma influência marcante na eletrostática do sítio ativo e no estado de ionização de seus resíduos. A acidez do nitrogênio alvo no substrato é importante na ligação do substrato ao local de ligação da enzima, que é comprovadamente hidrofóbico, embora tenha contato direto com a água. Asp27 é o único resíduo hidrofílico carregado no local de ligação, e a neutralização da carga no Asp27 pode alterar o pKa da enzima. O Asp27 desempenha um papel crítico no mecanismo catalítico, auxiliando na protonação do substrato e restringindo o substrato na conformação favorável à transferência do hidreto. A etapa de protonação está associada à tautomerização do enol, embora essa conversão não seja considerada favorável para a doação de prótons. Está provado que uma molécula de água está envolvida na etapa de protonação. A entrada da molécula de água no sítio ativo da enzima é facilitada pelo loop Met20.
Mudanças conformacionais de DHFR
O ciclo catalítico da reação catalisada por DHFR incorpora cinco intermediários importantes: holoenzima (E: NADPH), complexo de Michaelis (E: NADPH: DHF), complexo de produto ternário (E: NADP + : THF), complexo binário de tetrahidrofolato (E: THF ), e complexo THF‚NADPH (E: NADPH: THF). A etapa de dissociação do produto (THF) de E: NADPH: THF para E: NADPH é a etapa de determinação da taxa durante o turnover em estado estacionário.
Mudanças conformacionais são críticas no mecanismo catalítico de DHFR. O loop Met20 de DHFR é capaz de abrir, fechar ou obstruir o local ativo. Correspondentemente, três conformações diferentes classificadas como os estados aberto, fechado e ocluído são atribuídas ao Met20. Além disso, uma conformação distorcida extra de Met20 foi definida devido aos seus resultados de caracterização indistintos. A alça Met20 é observada em sua conformação ocluída nos três produtos intermediários de ligação, onde o anel de nicotinamida é ocluído do sítio ativo. Esta característica conformacional explica o fato de que a substituição de NADP + por NADPH é anterior à dissociação do produto. Assim, a próxima rodada de reação pode ocorrer após a ligação do substrato.
R67 DHFR
Devido à sua estrutura única e características catalíticas, o R67 DHFR é amplamente estudado. R67 DHFR é um DHFR codificado por R-plasmídeo tipo II sem relação genética e estrutural com o DHFR cromossômico de E. coli. É um homotetrâmero que possui a simetria 222 com um único poro de sítio ativo que é exposto ao solvente [nulo]. Esta simetria de sítio ativo resulta no modo de ligação diferente da enzima: Ele pode se ligar a duas moléculas de diidrofolato (DHF) com cooperatividade positiva ou duas moléculas NADPH com cooperatividade negativa, ou um substrato mais um, mas somente este último tem atividade catalítica. Em comparação com o DHFR cromossômico de E. coli, ele tem maior K m na ligação de diidrofolato (DHF) e NADPH. A cinética catalítica muito mais baixa mostra que a transferência de hidreto é a etapa de determinação da taxa, e não a liberação do produto (THF).
Na estrutura R67 DHFR, o homotetrâmero forma um poro de sítio ativo. No processo catalítico, DHF e NADPH entram no poro da posição oposta. A interação de empilhamento π-π entre o anel de nicotinamida do NADPH e o anel de pteridina do DHF conecta firmemente dois reagentes no sítio ativo. No entanto, a flexibilidade da cauda de p-aminobenzoilglutamato de DHF foi observada após a ligação, o que pode promover a formação do estado de transição.
Significado clínico
A deficiência de diidrofolato redutase foi associada à anemia megaloblástica . O tratamento é feito com formas reduzidas de ácido fólico. Como o tetrahidrofolato, o produto dessa reação, é a forma ativa do folato em humanos, a inibição do DHFR pode causar deficiência funcional de folato . DHFR é um alvo farmacêutico atraente para inibição devido ao seu papel fundamental na síntese de precursores de DNA. O trimetoprim , um antibiótico , inibe o DHFR bacteriano enquanto o metotrexato , um agente quimioterápico , inibe o DHFR de mamíferos. No entanto, a resistência se desenvolveu contra alguns medicamentos, como resultado de alterações mutacionais no próprio DHFR.
As mutações de DHFR causam um erro inato autossômico recessivo raro do metabolismo do folato que resulta em anemia megaloblástica , pancitopenia e deficiência cerebral grave de folato, que pode ser corrigida pela suplementação de ácido folínico .
Aplicações terapêuticas
Uma vez que o folato é necessário para as células em divisão rápida para produzir timina , este efeito pode ser usado com vantagem terapêutica.
DHFR pode ser direcionado no tratamento do câncer e como um alvo potencial contra infecções bacterianas. DHFR é responsável pelos níveis de tetrahidrofolato em uma célula, e a inibição de DHFR pode limitar o crescimento e a proliferação de células que são características de câncer e infecções bacterianas. Metotrexato , um inibidor competitivo de DHFR, é uma dessas drogas anticâncer que inibe DHFR. Outros medicamentos incluem trimetoprima e pirimetamina . Esses três são amplamente utilizados como agentes antitumorais e antimicrobianos. Outras classes de compostos que têm como alvo DHFR em geral, e DHFRs bacterianos em particular, pertencem às classes tais como diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, chalconas, desoxibenzoínas, para citar apenas alguns.
O trimetoprim demonstrou ter atividade contra uma variedade de patógenos bacterianos Gram-positivos . No entanto, a resistência ao trimetoprim e outras drogas direcionadas ao DHFR pode surgir devido a uma variedade de mecanismos, limitando o sucesso de seus usos terapêuticos. A resistência pode advir da amplificação do gene DHFR, mutações no DHFR, diminuição da captação dos fármacos, entre outros. Independentemente disso, o trimetoprim e o sulfametoxazol em combinação têm sido usados como um agente antibacteriano há décadas.
O folato é necessário para o crescimento e a via do metabolismo do folato é um alvo no desenvolvimento de tratamentos para o câncer. DHFR é um desses alvos. Um regime de fluorouracil , doxorrubicina e metotrexato demonstrou prolongar a sobrevida em pacientes com câncer gástrico avançado. Novos estudos sobre inibidores de DHFR podem levar a mais maneiras de tratar o câncer.
As bactérias também precisam de DHFR para crescer e se multiplicar e, portanto, os inibidores seletivos para DHFR bacteriana encontraram aplicação como agentes antibacterianos.
As classes de pequenas moléculas utilizadas como inibidores da di-hidrofolato redutase incluem diaminoquinazolina e diaminopirroloquinazolina, diaminopirimidina, diaminopteridina e diaminotriazinas.
Tratamento potencial para antraz
Diidrofolato redutase de Bacillus anthracis (BaDHFR) um alvo de droga validado no tratamento da doença infecciosa, o antraz. O BaDHFR é menos sensível aos análogos do trimetoprim do que a di-hidrofolato redutase de outras espécies, como Escherichia coli , Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae . Um alinhamento estrutural da di-hidrofolato redutase de todas as quatro espécies mostra que apenas BaDHFR tem a combinação fenilalanina e tirosina nas posições 96 e 102, respectivamente.
A resistência do BaDHFR aos análogos do trimetoprim é devida a esses dois resíduos (F96 e Y102), que também conferem cinética e eficiência catalítica aprimoradas. A pesquisa atual usa mutantes de sítio ativo em BaDHFR para orientar a otimização de chumbo para novos inibidores de antifolato.
Como ferramenta de pesquisa
DHFR tem sido usado como uma ferramenta para detectar interações proteína-proteína em um ensaio de complementação de fragmento de proteína (PCA).
Células CHO
DHFR sem células CHO são a linha celular mais comumente usada para a produção de proteínas recombinantes. Essas células são transfectadas com um plasmídeo portador do gene dhfr e do gene para a proteína recombinante em um único sistema de expressão e, em seguida, submetidas a condições seletivas em meio sem timidina . Apenas as células com o gene DHFR exógeno junto com o gene de interesse sobrevivem.
Interações
Foi demonstrado que a diidrofolato redutase interage com GroEL e Mdm2 .
Mapa de caminho interativo
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Referências
Leitura adicional
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links externos
- Palestra do Nobel de Medicina de 1988
- Proteopedia: dihidrofolato redutase
- Visão geral de todas as informações estruturais disponíveis no PDB para UniProt : P00374 ( Diidrofolato redutase) no PDBe-KB .