QPNC-PAGE - QPNC-PAGE
QPNC-PAGE , ou eletroforese em gel de poliacrilamida contínua preparativa quantitativa , é uma técnica bioanalítica de alta resolução e alta precisão aplicada em bioquímica e química bioinorgânica para separar proteínas quantitativamente por ponto isoelétrico . Esta variante padronizada da eletroforese em gel nativo é usada por biólogos para isolar biomacromoléculas em solução, por exemplo, metaloproteínas ativas ou nativas em amostras biológicas ou proteínas contendo cofator metálico dobrado de maneira adequada e inadequada ou isoformas de proteínas em misturas de proteínas complexas .
Introdução
As proteínas desempenham várias funções em organismos vivos , incluindo reações catalíticas e transporte de moléculas ou íons dentro das células , órgãos ou todo o corpo . A compreensão dos processos em organismos humanos, que são impulsionados principalmente por reações bioquímicas e interações proteína-proteína , depende em grande medida de nossa capacidade de isolar proteínas ativas em amostras biológicas para um exame mais detalhado da estrutura química e função fisiológica . Essas informações essenciais podem significar uma indicação importante do estado de saúde de um paciente .
Como cerca de 30-40% de todas as proteínas conhecidas contêm um ou mais cofatores de íons metálicos (por exemplo, ceruloplasmina , ferritina , proteína precursora de amilóide , metaloproteinase de matriz ), especialmente metaloproteínas nativas devem ser isoladas, identificadas e quantificadas após biópsia líquida . Muitos desses cofatores (por exemplo, ferro , cobre ou zinco ) desempenham um papel fundamental nos processos catalíticos enzimáticos vitais ou estabilizam as moléculas de proteína globular . Portanto, a eletroforese de alta precisão e outras técnicas de separação nativas são altamente relevantes como etapa inicial da análise de especiação de proteínas e metais traço, subsequentemente, seguida por espectrometria de massa e métodos de ressonância magnética para quantificar e identificar as proteínas solúveis de interesse.
Método
Mecanismos de separação e buffer
Na eletroforese em gel, as proteínas são normalmente separadas por carga , tamanho ou forma . O objetivo da focalização isoelétrica (IEF), por exemplo, é separar as proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI), portanto, de acordo com sua carga em diferentes valores de pH . Aqui, o mesmo mecanismo é realizado em uma câmara de eletroforese disponível comercialmente (consulte a figura Equipamento ) para separar biomoléculas carregadas , por exemplo, superóxido dismutase (SOD) ou alérgenos , em condições de pH contínuas e diferentes velocidades de migração dependendo de diferentes pontos isoelétricos. As proteínas separadas (metal) eluem sequencialmente, começando com o mais baixo (pI> 2-4) e terminando com o mais alto pI (pI <10,0) das moléculas de proteína presentes.
Devido às propriedades específicas do gel preparado e da solução tampão de eletroforese (que é básica e contém Tris - HCl e NaN 3 ), a maioria das proteínas de um sistema biológico (por exemplo, Helicobacter pylori ) são carregadas negativamente na solução e irão migrar de o cátodo para o ânodo devido ao campo elétrico . No ânodo, íons de hidrogênio gerados eletroquimicamente reagem com moléculas de Tris para formar íons de Tris monovalentes . Os íons Tris carregados positivamente migram através do gel para o cátodo, onde neutralizam os íons hidróxido para formar moléculas de Tris e água . Assim, o mecanismo de tamponamento baseado em Tris causa um pH constante no sistema tampão. A 25 ° C, o tampão Tris tem uma faixa de pH eficaz entre 7,5 e 9,0. Sob as condições fornecidas aqui (abordando a concentração, mecanismo de tamponamento, pH e temperatura), o pH efetivo é deslocado na faixa de cerca de 10,0 a 10,5. Todos os sistemas tampão nativos têm baixa condutividade e variam em pH de 3,8 a 10,2. Sistemas tampão nativos contínuos são usados para separar proteínas de acordo com seu pI.
Embora o valor de pH (10,00) do tampão de eletroforese não corresponda a um valor de pH fisiológico dentro de uma célula ou tipo de tecido , as bandas de proteína em forma de anel separadas são eluídas continuamente em uma solução tampão fisiológica (pH 8,00) e isoladas em diferentes frações (veja a figura Eletroferograma ). Desde que a desnaturação irreversível não possa ser demonstrada (por um procedimento independente), a maioria das moléculas de proteína são estáveis em solução aquosa, em valores de pH de 3 a 10 se a temperatura estiver abaixo de 50 ° C. Como o calor e a temperatura de Joule gerados durante a eletroforese podem exceder 50 ° C e, portanto, ter um impacto negativo na estabilidade e no comportamento de migração das proteínas, o sistema de separação, incluindo a câmara de eletroforese e um coletor de frações, é resfriado em um refrigerador a 4 ° C. O superaquecimento do gel é impedido pelo resfriamento interno da coluna de gel e pela geração de uma potência constante (veja a figura Equipamento ).
Propriedades do gel e tempo de polimerização
As melhores condições de polimerização para géis de acrilamida são obtidas a 25-30 ° C e a polimerização parece terminada após 20-30 min de reação, embora monômeros residuais (10-30%) sejam detectados após este tempo. A copolimerização de reticulador de acrilamida (AA) monômero / N, N'-metilenobisacrilamida (Bis-AA) iniciada por reações de persulfato de amônio (APS) / tetrametiletilenodiamina (TEMED) é mais eficiente em pH alcalino. Desse modo, cadeias de acrilamida são criadas e reticuladas de cada vez. Devido às propriedades do tampão de eletroforese, a polimerização em gel é conduzida em pH 10,00 garantindo um uso eficiente de TEMED e APS como catalisadores da reação de polimerização e, simultaneamente, suprimindo uma hidrólise competitiva da rede de polímero de acrilamida produzida . Caso contrário, as proteínas poderiam ser modificadas por reação com monômeros não polimerizados de acrilamida, formando produtos de adução de acrilamida covalentes que podem resultar em bandas múltiplas.
Além disso, o tempo de polimerização de um gel pode afetar diretamente os tempos de pico de eluição de metaloproteínas separadas no eletroferograma devido à compressão e dilatação dos géis e seus poros com os tempos de incubação mais longos (ver figura Eletroferograma , cf. Reprodutibilidade e recuperação ) A fim de garantir a reprodutibilidade máxima no tamanho do poro do gel e para obter um gel de poro grande totalmente polimerizado e não restritivo para uma execução de PAGE, o gel de poliacrilamida é polimerizado por um período de 69 horas à temperatura ambiente (RT). O calor exotérmico gerado pelos processos de polimerização é dissipado constantemente, enquanto a temperatura pode subir rapidamente para mais de 75 ° C nos primeiros minutos, após o que cai lentamente. Após 69 horas, o gel atingiu a temperatura ambiente e, portanto, está em seu estado de menor energia porque as reações químicas e a gelificação são encerradas. Gelificação significa que o solvente (água) fica imobilizado dentro da rede polimérica por meio de ligações de hidrogênio e também por forças de van der Waals . Como resultado, o gel preparado é homogêneo (em termos de distribuição homogênea de ligações cruzadas em toda a amostra de gel), inerentemente estável e livre de monômeros ou radicais . Os géis de poliacrilamida frescos são ainda hidrofílicos , eletricamente neutros e não ligam proteínas. Os efeitos de peneiramento devido à compressão do gel induzida pela gravidade podem ser excluídos pelas mesmas razões. Em um meio sem propriedades de peneiramento molecular, pode-se esperar uma alta resolução.
Antes de uma corrida eletroforética ser iniciada, o gel preparado a 4% T (teor de polímero total (T)), 2,67% C (concentração de reticulador (C)) é pré-executado para equilibrá-lo. É essencialmente não-peneiração e óptima para a electroforese de proteínas superior ou igual a 200 k u (cf. em gel de agarose de electroforese ). As proteínas migram nele mais ou menos com base em sua mobilidade livre. Por essas razões, as interações do gel com as biomoléculas são desprezivelmente baixas e, portanto, as proteínas se separam de forma limpa e previsível em um tempo de polimerização de 69 horas (ver figura Eletroferograma ). Os metaloproteínas separadas incluindo biomoléculas que variam de cerca de <1 ku para maior do que 30 Ku (por exemplo, de metal chaperonas , priões , proteínas de transporte de metal, amilóides , metaloenzimas, metalo péptidos , metalotioneína , fitoquelatinas ) não são dissociados em apoproteas e cofactores de metal.
Reprodutibilidade e recuperação
As estruturas bioativas ( conformação ou forma nativa ou 3D ) das moléculas de proteína isoladas não sofrem nenhuma alteração conformacional significativa . Assim, proteínas contendo cofator de metal ativo podem ser isoladas de forma reproduzível nas mesmas frações após uma execução de PAGE (ver figura Eletroferograma ). Um pico de deslocamento no respectivo eletroferograma pode indicar que o tempo padronizado de polimerização em gel (69 h, RT) não é implementado em um experimento PAGE . Um desvio inferior do tempo de polimerização padronizado (<69 h) significa polimerização incompleta e, portanto, instabilidade inerente devido ao amolecimento do gel durante a reticulação de polímeros conforme o material atinge o equilíbrio de dilatação, embora excedendo este limite de tempo (> 69 h) é um indicador de envelhecimento do gel. O fenômeno do envelhecimento do gel está intimamente relacionado à diminuição a longo prazo da viscosidade das soluções aquosas de poliacrilamida e ao aumento do inchaço dos hidrogéis.
Sob condições padrão (69 horas), metaloproteínas com diferentes faixas de massa molecular e pontos isoelétricos foram recuperadas na forma biologicamente ativa com um rendimento quantitativo de mais de 95%. Por SDS preparativa eletroforese em gel de poliacrilamida, proteínas padrão ( citocromo c , aldolase , ovalbumina e albumina de soro bovino ) com massas moleculares de 14-66 ku podem ser recuperadas com um rendimento médio de cerca de 73,6%. Isotacoforese preparativa (ITP) é aplicada para isolar proteínas contendo paládio com massas moleculares de 362 ku (recuperação: 67%) e 158 ku (recuperação: 97%).
Quantificação e identificação
As concentrações fisiológicas ( faixa de ppb ) de Fe, Cu, Zn, Ni , Mo , Pd, Co , Mn , Pt , Cr , Cd e outros cofatores metálicos podem ser identificados e absolutamente quantificados em uma alíquota de uma fração por massa de plasma indutivamente acoplada espectrometria (ICP-MS) ou fluorescência de raios-X de reflexão total (TXRF), por exemplo. No caso de ICP-MS, a informação estrutural das metalobiomoléculas associadas é irreversivelmente perdida devido à ionização da amostra com plasma . Outro método de detecção de alta sensibilidade estabelecido para a determinação de elementos (traços) é a espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GF-AAS) (veja a figura Eletroferograma ). Por causa da alta pureza e concentração otimizada das metaloproteínas separadas, por exemplo, produtos farmacêuticos feitos de plantas recombinantes terapêuticos , como chaperone de cobre para superóxido dismutase (CCS) de plantas medicinais , em algumas frações PAGE específicas, as estruturas relacionadas desses analitos podem ser elucidado quantitativamente usando espectroscopia de NMR de solução em condições não desnaturantes.
Formulários
Proteínas metálicas incorretamente dobradas, por exemplo, CCS ou Cu / Zn-superóxido dismutase (SOD1) presentes no cérebro , sangue ou outras amostras clínicas, são indicativas de doenças neurodegenerativas como doença de Alzheimer (DA) ou esclerose lateral amiotrófica (ALS). As moléculas de CCS ou SOD ativas contribuem para o controle homeostático intracelular de íons metálicos essenciais (por exemplo, Cu 1 + / 2 + , Zn 2+ , Fe 2 + / 3 + , Mn 2+ , Ni 3+ ) em organismos e, portanto, estes as biomoléculas podem equilibrar os processos pró- oxidativos e antioxidantes no citoplasma . Caso contrário, íons de metais de transição livres (fracamente ligados) participam de reações semelhantes a Fenton nas quais radicais hidroxila deletérios são formados, os quais irrestritos seriam destrutivos para as proteínas. A perda de CCS (ativa) aumenta a produção de β-amiloide nos neurônios que, por sua vez, é a principal marca patológica da DA. Portanto, a chaperona de cobre para superóxido dismutase é proposta como um dos biomarcadores mais promissores da toxicidade do cobre nessas doenças. O CCS deve ser analisado principalmente no sangue porque uma meta-análise dos dados séricos mostrou que os pacientes com DA têm níveis mais elevados de Cu sérico do que os controles saudáveis.
Veja também
Referências
links externos
- Capítulos sobre Eletroforese em Gel 1-D / 2-D e Foco Isoelétrico são fornecidos pelo Centro de Aprendizagem da Sociedade de Eletroforese AES: Focos
- Protocolos de purificação de proteínas pela Universidade Hebraica de Jerusalém