Hibridização genômica comparativa - Comparative genomic hybridization

A hibridização genômica comparativa (CGH) é um método citogenético molecular para analisar variações do número de cópias (CNVs) em relação ao nível de ploidia no DNA de uma amostra de teste em comparação com uma amostra de referência, sem a necessidade de cultura de células. O objetivo desta técnica é comparar de forma rápida e eficiente duas amostras de DNA genômico provenientes de duas fontes, que são na maioria das vezes intimamente relacionadas, porque se suspeita que elas contêm diferenças em termos de ganhos ou perdas de cromossomos inteiros ou regiões subcromossômicas(uma porção de um cromossomo inteiro). Esta técnica foi originalmente desenvolvida para a avaliação das diferenças entre os complementos cromossômicos de tumor sólido e tecido normal, e tem uma resolução melhorada de 5-10 megabases em comparação com as técnicas de análise citogenética mais tradicionais de bandamento de giemsa e hibridização fluorescente in situ (FISH ), que são limitados pela resolução do microscópio utilizado.

Isso é conseguido através do uso de hibridização in situ fluorescente competitiva. Em suma, isso envolve o isolamento do DNA das duas fontes a serem comparadas, mais comumente uma fonte de teste e de referência, marcação independente de cada amostra de DNA com fluoróforos (moléculas fluorescentes) de cores diferentes (geralmente vermelho e verde), desnaturação do DNA de forma que seja de fita simples, e a hibridização das duas amostras resultantes em uma proporção de 1: 1 para uma propagação de metáfase normal de cromossomos, aos quais as amostras de DNA marcadas se ligarão em seu locus de origem. Usando um microscópio de fluorescência e software de computador, os sinais fluorescentes de cores diferentes são comparados ao longo do comprimento de cada cromossomo para identificação de diferenças cromossômicas entre as duas fontes. Uma intensidade mais alta da cor da amostra de teste em uma região específica de um cromossomo indica o ganho de material dessa região na amostra de origem correspondente, enquanto uma intensidade mais alta da cor da amostra de referência indica a perda de material na amostra de teste naquele específico região. Uma cor neutra (amarelo quando os rótulos do fluoróforo são vermelhos e verdes) indica que não há diferença entre as duas amostras naquele local.

O CGH só é capaz de detectar anomalias cromossômicas desequilibradas . Isso ocorre porque as anormalidades cromossômicas equilibradas, como translocações recíprocas , inversões ou cromossomos em anel , não afetam o número de cópias, que é o que é detectado pelas tecnologias CGH. O CGH, entretanto, permite a exploração de todos os 46 cromossomos humanos em um único teste e a descoberta de deleções e duplicações, mesmo em escala microscópica, o que pode levar à identificação de genes candidatos a serem explorados por outras técnicas citológicas.

Através do uso de microarranjos de DNA em conjunto com técnicas de CGH, a forma mais específica de CGH array (aCGH) foi desenvolvida, permitindo uma medida locus por locus de CNV com resolução aumentada de até 100 kilobases . Esta técnica aprimorada permite que a etiologia de condições conhecidas e desconhecidas seja descoberta.

História

A motivação subjacente ao desenvolvimento do CGH decorreu do facto de as formas de análise citogenética disponíveis na altura ( giemsa banding e FISH ) serem limitadas na sua resolução potencial pelos microscópios necessários à interpretação dos resultados por eles fornecidos. Além disso, a interpretação das bandas de giemsa tem o potencial de ser ambígua e, portanto, tem confiabilidade reduzida, e ambas as técnicas requerem altas entradas de mão-de-obra, o que limita os loci que podem ser examinados.

O primeiro relatório de análise de CGH foi feito por Kallioniemi e colegas em 1992 na Universidade da Califórnia, em San Francisco, que utilizou CGH na análise de tumores sólidos. Eles conseguiram isso pela aplicação direta da técnica a ambas as linhas de células de câncer de mama e tumores primários de bexiga , a fim de estabelecer cariótipos de número de cópias completo para as células. Eles foram capazes de identificar 16 regiões diferentes de amplificação, muitas das quais eram novas descobertas.

Logo depois, em 1993, du Manoir et al. relatou praticamente a mesma metodologia. Os autores pintaram uma série de cromossomos humanos individuais de uma biblioteca de DNA com dois fluoróforos diferentes em proporções diferentes para testar a técnica e também aplicaram CGH ao DNA genômico de pacientes afetados com síndrome de Downs ou leucemia prolinfocítica de células T , bem como células de uma linha de células de carcinoma papilar renal. Concluiu-se que as razões de fluorescência obtidas foram precisas e que as diferenças entre o DNA genômico de diferentes tipos de células foram detectáveis ​​e, portanto, que o CGH foi uma ferramenta de análise citogenética altamente útil.

Inicialmente, o uso generalizado da tecnologia CGH foi difícil, pois os protocolos não eram uniformes e, portanto, surgiram inconsistências, principalmente devido às incertezas na interpretação dos dados. No entanto, em 1994 foi publicada uma revisão que descreveu em detalhes um protocolo de fácil compreensão e o software de análise de imagens foi disponibilizado comercialmente, o que permitiu que o CGH fosse utilizado em todo o mundo. À medida que novas técnicas, tais como microdisseco e degenerado de oligonucleótidos preparado reacção em cadeia da polimerase (DOP-PCR), se tornaram disponíveis para a geração de produtos de ADN, que era possível aplicar o conceito de CGH para anomalias cromossómicas mais pequenas e, portanto, a resolução de CGH foi melhorada.

A implementação do array CGH, em que microarrays de DNA são usados ​​em vez da preparação cromossômica metafásica tradicional, foi iniciada por Solinas-Tolodo et al. em 1997 usando células tumorais e Pinkel et al. em 1998, pelo uso de células de câncer de mama. Isso foi possível pelo Projeto Genoma Humano, que gerou uma biblioteca de fragmentos de DNA clonados com localizações conhecidas em todo o genoma humano , com esses fragmentos sendo usados ​​como sondas no microarray de DNA. Agora, sondas de várias origens, como cDNA, produtos genômicos de PCR e cromossomos artificiais bacterianos (BACs), podem ser usadas em microarranjos de DNA que podem conter até 2 milhões de sondas. Array CGH é automatizado, permite maior resolução (até 100 kb) do que o CGH tradicional, pois as sondas são muito menores do que as preparações de metáfase, requerem quantidades menores de DNA, podem ser direcionadas para regiões cromossômicas específicas se necessário e são ordenadas e, portanto, mais rápidas de analisar , tornando-o muito mais adaptável a usos diagnósticos.

Figura 1. Esquema do protocolo CGH

Métodos básicos

Preparação da lâmina de metafase

O DNA da lâmina é uma amostra de referência e, portanto, obtido de um homem ou mulher cariotipicamente normal, embora seja preferível usar DNA feminino, pois eles possuem dois cromossomos X que contêm muito mais informações genéticas do que o cromossomo Y masculino. São usados ​​linfócitos de sangue periférico estimulados por fitohemaglutinina. 1 mL de sangue heparinizado é adicionado a 10 ml de meio de cultura e incubadas durante 72 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 . Colchicina é adicionada para prender as células em mitose, as células são então colhidas e tratadas com cloreto de potássio hipotônico e fixadas em metanol / ácido acético 3: 1 .

Uma gota da suspensão de células deve ser colocada em uma lâmina limpa com etanol a uma distância de cerca de 30 cm, idealmente isso deve ser realizado em temperatura ambiente com níveis de umidade de 60-70%. As lâminas devem ser avaliadas por visualização usando um microscópio de contraste de fase, citoplasma mínimo deve ser observado e os cromossomos não devem se sobrepor e ter 400–550 bandas de comprimento sem cromátides separadas e, finalmente, devem parecer escuros em vez de brilhantes. As lâminas então precisam ser secas ao ar durante a noite em temperatura ambiente, e qualquer armazenamento posterior deve ser em grupos de quatro a −20 ° C com esferas de sílica ou nitrogênio presentes para manter a secura. Diferentes doadores devem ser testados, pois a hibridização pode ser variável. Lâminas comercialmente disponíveis podem ser usadas, mas sempre devem ser testadas primeiro.

Isolamento de DNA do tecido de teste e tecido de referência

A extração de fenol padrão é usada para obter DNA de tecido de teste ou de referência (indivíduo cariotipicamente normal), que envolve a combinação de ácido Tris - etilenodiaminotetracético e fenol com DNA aquoso em quantidades iguais. Isto é seguido por separação por agitação e centrifugação, após o que a camada aquosa é removida e posteriormente tratada com éter e, finalmente, precipitação com etanol é usada para concentrar o DNA.

Pode ser concluído usando kits de isolamento de DNA disponíveis comercialmente que são baseados em colunas de afinidade .

Preferencialmente, o DNA deve ser extraído de tecido fresco ou congelado, pois será da mais alta qualidade, embora agora seja possível usar material de arquivo que é fixado em formalina ou embebido em cera de parafina, desde que os procedimentos apropriados sejam seguidos. 0,5-1 μg de DNA é suficiente para o experimento de CGH, embora se a quantidade desejada não for obtida DOP-PCR pode ser aplicado para amplificar o DNA, no entanto, neste caso, é importante aplicar DOP-PCR tanto para o teste como amostras de DNA de referência para melhorar a confiabilidade.

Rotulagem de DNA

A tradução de nick é usada para marcar o DNA e envolve o corte do DNA e a substituição de nucleotídeos marcados com fluoróforos (marcação direta) ou biotina ou oxigenina para que os anticorpos conjugados com fluóforo sejam adicionados posteriormente (marcação indireta). É importante verificar os comprimentos dos fragmentos do DNA de teste e de referência por eletroforese em gel , pois eles devem estar na faixa de 500kb-1500kb para uma hibridização ideal.

Bloqueando

O DNA Cot-1 não marcado da Life Technologies Corporation (DNA placentário enriquecido com sequências repetitivas de comprimento 50bp-100bp) é adicionado para bloquear sequências de DNA repetitivas normais, particularmente em centrômeros e telômeros , pois essas sequências, se detectadas, podem reduzir a razão de fluorescência e causar ganhos ou perdas para escapar da detecção.

Hibridização

8-12 μl de cada teste rotulado e DNA de referência rotulado são misturados e 40 μg de DNA Cot-1 são adicionados, depois precipitados e subsequentemente dissolvidos em 6 μl de mistura de hibridização, que contém 50% de formamida para diminuir a temperatura de fusão do DNA e 10% de sulfato de dextrano para aumentar a concentração efetiva da sonda em uma solução salina de citrato de sódio (SSC) a um pH de 7,0.

A desnaturação da lâmina e das sondas é realizada separadamente. A lâmina é submersa em formamida 70% / 2xSSC por 5–10 minutos a 72 ° C, enquanto as sondas são desnaturadas por imersão em banho-maria a 80 ° C por 10 minutos e são imediatamente adicionadas à preparação da lâmina em metáfase. Esta reação é então coberta com uma lamela e deixada por dois a quatro dias em uma câmara úmida a 40 ° C.

A lamela é então removida e lavagens de 5 minutos são aplicadas, três usando 2xSSC em temperatura ambiente, uma a 45 ° C com 0,1xSSC e uma usando TNT em temperatura ambiente. A reação é então pré-incubada por 10 minutos, seguida por 60 minutos, 37 ° C de incubação, mais três lavagens de 5 minutos com TNT e então uma com 2xSSC em temperatura ambiente. A lâmina é então seca usando uma série de etanol de 70% / 96% / 100% antes da contracoloração com DAPI (0,35 μg / ml), para identificação cromossômica e selagem com uma lamela.

Visualização e imagem de fluorescência

Um microscópio de fluorescência com os filtros apropriados para a coloração DAPI , bem como os dois fluoróforos utilizados, é necessário para a visualização, e esses filtros também devem minimizar a interferência entre os fluoróforos, como filtros de passagem de banda estreita. O microscópio deve fornecer iluminação uniforme sem variação cromática , estar devidamente alinhado e ter uma objetiva do tipo "plano" que é apocromática e dar uma ampliação de x63 ou x100.

A imagem deve ser gravada usando uma câmera com resolução espacial de pelo menos 0,1 μm no nível da amostra e dar uma imagem de pelo menos 600x600 pixels. A câmera também deve ser capaz de integrar a imagem por pelo menos 5 a 10 segundos, com resolução fotométrica mínima de 8 bits.

O software CGH dedicado está disponível comercialmente para a etapa de processamento de imagem e é necessário para subtrair o ruído de fundo, remover e segmentar materiais não de origem cromossômica, normalizar a razão de fluorescência, realizar cariótipo interativo e escalonamento de cromossomos para o comprimento padrão. Um "cariótipo de número de cópias relativo" que apresenta áreas cromossômicas de deleções ou amplificações é gerado calculando a média das proporções de uma série de metáfases de alta qualidade e plotando-as ao longo de um ideograma, um diagrama que identifica cromossomos com base em padrões de bandas. A interpretação dos perfis de razão é realizada usando limites fixos ou estatísticos ( intervalos de confiança ). Ao usar intervalos de confiança, ganhos ou perdas são identificados quando 95% da razão de fluorescência não contém 1,0.

Notas extras

Deve-se tomar muito cuidado para evitar a contaminação de qualquer etapa que envolva o DNA, especialmente com o DNA de teste, pois a contaminação da amostra com DNA normal distorce os resultados para mais perto de 1,0, portanto, as anormalidades podem não ser detectadas. Experimentos de FISH, PCR e citometria de fluxo podem ser empregados para confirmar os resultados.

Hibridização genômica comparativa de matriz

Hibridização genômica comparativa de matriz (também hibridização genômica comparativa baseada em microarray, CGH de matriz, CGH de matriz, aCGH) é uma técnica citogenética molecular para a detecção de alterações no número de cópias cromossômicas em uma escala ampla e de alta resolução do genoma. Array CGH compara o genoma do paciente com um genoma de referência e identifica diferenças entre os dois genomas e, portanto, localiza regiões de desequilíbrios genômicos no paciente, utilizando os mesmos princípios de hibridização in situ de fluorescência competitiva que o CGH tradicional.

Com a introdução do array CGH, a principal limitação do CGH convencional, a baixa resolução, é superada. No array CGH, os cromossomos metafásicos são substituídos por fragmentos de DNA clonados (+ 100–200 kb), cuja localização cromossômica exata é conhecida. Isso permite a detecção de aberrações com mais detalhes e, além disso, torna possível mapear as alterações diretamente na sequência genômica.

O Array CGH provou ser uma técnica específica, sensível, rápida e de alto rendimento, com vantagens consideráveis ​​em comparação com outros métodos usados ​​para a análise de alterações no número de cópias de DNA, tornando-o mais acessível para aplicações diagnósticas. Usando este método, as alterações no número de cópias em um nível de 5 a 10 quilobases de sequências de DNA podem ser detectadas. A partir de 2006, mesmo matrizes CGH de alta resolução ( HR-CGH ) são precisas para detectar variações estruturais (SV) com resolução de 200 bp. Este método permite identificar novas alterações cromossômicas recorrentes, como microdeleções e duplicações em condições humanas, como câncer e defeitos congênitos devido a aberrações cromossômicas.

Figura 2. Protocolo Array-CGH

Metodologia

O array CGH é baseado no mesmo princípio do CGH convencional. Em ambas as técnicas, o DNA de uma amostra de referência (ou controle) e o DNA de uma amostra de teste (ou paciente) são marcados diferencialmente com dois fluoróforos diferentes e usados ​​como sondas que são co-hibridizadas competitivamente em alvos de ácido nucleico . No CGH convencional, o alvo é uma propagação de metáfase de referência. Na matriz CGH, esses alvos podem ser fragmentos genômicos clonados em uma variedade de vetores (como BACs ou plasmídeos ), cDNAs ou oligonucleotídeos .

A Figura 2. é uma visão geral esquemática da técnica CGH array. O DNA da amostra a ser testada é marcado com um fluoróforo vermelho ( cianina 5) e uma amostra de DNA de referência é marcada com fluoróforo verde (cianina 3). Quantidades iguais das duas amostras de DNA são misturadas e co-hibridizadas para um microarray de DNA de vários milhares de fragmentos de DNA clonado uniformemente espaçados ou oligonucleotídeos, que foram manchados em triplicado no array. Após a hibridização, os sistemas de imagem digital são usados ​​para capturar e quantificar as intensidades relativas de fluorescência de cada um dos fluoróforos hibridizados. A proporção resultante das intensidades de fluorescência é proporcional à proporção do número de cópias das sequências de DNA nos genomas de teste e de referência. Se as intensidades dos flurocromos forem iguais em uma sonda, essa região do genoma do paciente é interpretada como tendo igual quantidade de DNA nas amostras teste e referência; se houver uma proporção Cy3: Cy5 alterada, isso indica uma perda ou um ganho do DNA do paciente naquela região genômica específica.

Abordagens tecnológicas para array CGH

Perfil ACGH da linha celular de neuroblastoma IMR32

Array CGH foi implementado usando uma ampla variedade de técnicas. Portanto, algumas das vantagens e limitações do CGH array dependem da técnica escolhida. As abordagens iniciais usaram matrizes produzidas a partir de grandes clones de DNA genômico de inserção, como BACs . O uso de BACs fornece sinais intensos suficientes para detectar alterações de cópia única e localizar limites de aberração com precisão. No entanto, os rendimentos iniciais de DNA de clones BAC isolados são baixos e as técnicas de amplificação de DNA são necessárias. Essas técnicas incluem reação em cadeia da polimerase mediada por ligação (PCR), PCR de primer degenerado usando um ou vários conjuntos de primers e amplificação por círculo rolante . As matrizes também podem ser construídas usando cDNA. Essas matrizes atualmente produzem uma alta resolução espacial, mas o número de cDNAs é limitado pelos genes que são codificados nos cromossomos e sua sensibilidade é baixa devido à hibridização cruzada. Isso resulta na incapacidade de detectar alterações em uma única cópia em uma escala ampla do genoma. A abordagem mais recente é localizar as matrizes com oligonucleotídeos curtos. A quantidade de oligos é quase infinita e o processamento é rápido, econômico e fácil. Embora os oligonucleotídeos não tenham a sensibilidade para detectar alterações de cópia única, a média das razões dos oligos que mapeiam um ao lado do outro no cromossomo pode compensar a sensibilidade reduzida. Também é possível usar arrays que têm probes sobrepostos para que pontos de interrupção específicos possam ser descobertos.

Abordagens de design

Existem duas abordagens para o projeto de microarrays para aplicações CGH: genoma completo e direcionado.

Matrizes de genoma inteiro são projetadas para cobrir todo o genoma humano. Eles geralmente incluem clones que fornecem uma ampla cobertura em todo o genoma; e matrizes que possuem cobertura contígua, dentro dos limites do genoma. Matrizes de genoma inteiro foram construídas principalmente para aplicações de pesquisa e provaram seu valor notável na descoberta de genes. Eles também são muito valiosos na triagem do genoma quanto a ganhos e perdas de DNA em uma resolução sem precedentes.

Matrizes direcionadas são projetadas para uma (s) região (ões) específica (s) do genoma com o propósito de avaliar esse segmento direcionado. Pode ser projetado para estudar um cromossomo específico ou segmento cromossômico ou para identificar e avaliar anormalidades de dosagem de DNA específicas em indivíduos com suspeita de síndromes de microdeleção ou rearranjos subteloméricos. O objetivo crucial de um microarray direcionado na prática médica é fornecer resultados clinicamente úteis para diagnóstico, aconselhamento genético, prognóstico e gerenciamento clínico de anormalidades citogenéticas desequilibradas.

Formulários

Convencional

O CGH convencional tem sido usado principalmente para a identificação de regiões cromossômicas que são perdidas ou ganhas recorrentemente em tumores, bem como para o diagnóstico e prognóstico do câncer. Esta abordagem também pode ser usada para estudar aberrações cromossômicas em genomas fetais e neonatais . Além disso, o CGH convencional pode ser usado na detecção de anormalidades cromossômicas e tem se mostrado eficiente no diagnóstico de anormalidades complexas associadas a distúrbios genéticos humanos.

Na pesquisa do câncer

Os dados de CGH de vários estudos do mesmo tipo de tumor mostram padrões consistentes de aberrações genéticas não aleatórias. Algumas dessas alterações parecem ser comuns a vários tipos de tumores malignos, enquanto outras são mais específicas do tumor. Por exemplo, ganhos de regiões cromossômicas lq, 3q e 8q, bem como perdas de 8p, 13q, 16q e 17p, são comuns a uma série de tipos de tumor, como câncer de mama, ovário, próstata, renal e de bexiga (Figura. 3). Outras alterações, como ganhos de 12p e Xp no câncer testicular, ganho de 13q, perda de 9q no câncer de bexiga, perda de 14q no câncer renal e perda de Xp no câncer de ovário, são mais específicas e podem refletir as forças de seleção únicas que operam durante o desenvolvimento do câncer em diferentes órgãos . O Array CGH também é freqüentemente usado na pesquisa e no diagnóstico de doenças malignas de células B, como a leucemia linfocítica crônica.

Aberrações cromossômicas

Cri du Chat (CdC) é uma síndrome causada por uma deleção parcial do braço curto do cromossomo 5. Vários estudos têm mostrado que o CGH convencional é adequado para detectar a deleção, bem como alterações cromossômicas mais complexas. Por exemplo, Levy et al. (2002) relataram um bebê com um choro de gato, a marca registrada do CdC, mas com um cariótipo indistinto. A análise de CGH revelou uma perda de material cromossômico de 5p15.3 confirmando o diagnóstico clinicamente. Esses resultados demonstram que o CGH convencional é uma técnica confiável na detecção de aberrações estruturais e, em casos específicos, pode ser mais eficiente no diagnóstico de anormalidades complexas.

Array CGH

As aplicações do array CGH são principalmente direcionadas à detecção de anormalidades genômicas no câncer. No entanto, o array CGH também é adequado para a análise de aberrações de número de cópias de DNA que causam distúrbios genéticos humanos. Ou seja, a matriz CGH é empregada para descobrir deleções, amplificações, pontos de interrupção e anormalidades de ploidia. O diagnóstico precoce é benéfico para o paciente, pois ele pode ser submetido a tratamentos e aconselhamento adequados para melhorar seu prognóstico.

Anormalidades genômicas no câncer

Alterações e rearranjos genéticos ocorrem com frequência no câncer e contribuem para sua patogênese. A detecção dessas aberrações por CGH array fornece informações sobre a localização de genes importantes do câncer e pode ter uso clínico no diagnóstico, classificação e prognostificação do câncer. No entanto, nem todas as perdas de material genético são patogenéticas, uma vez que parte do material de DNA é fisiologicamente perdido durante o rearranjo dos subgenes das imunoglobulinas. Em um estudo recente, o array CGH foi implementado para identificar regiões de aberração cromossômica ( variação do número de cópias ) em vários modelos de câncer de mama em camundongos, levando à identificação de genes cooperantes durante a oncogênese induzida por myc.

O Array CGH também pode ser aplicado não apenas à descoberta de anormalidades cromossômicas no câncer, mas também ao monitoramento da progressão dos tumores. A diferenciação entre lesões metastáticas e leves também é possível usando FISH, uma vez que as anormalidades foram identificadas por CGH array.

Aberrações submicroscópicas

A síndrome de Prader-Willi (PWS) é uma anormalidade estrutural paterna envolvendo 15q11-13, enquanto uma aberração materna na mesma região causa a síndrome de Angelman (AS). Em ambas as síndromes, a maioria dos casos (75%) é o resultado de uma deleção de 3–5 Mb da região crítica de PWS / AS. Essas pequenas aberrações não podem ser detectadas usando citogenética ou CGH convencional, mas podem ser facilmente detectadas usando CGH array. Como prova de princípio, Vissers et al. (2003) construíram uma ampla gama de genomas com resolução de 1 Mb para triagem de três pacientes com síndromes de microdeleção conhecidas e confirmadas por FISH, incluindo um com PWS. Em todos os três casos, as anormalidades, variando de 1,5 a 2,9 Mb, foram prontamente identificadas. Assim, a matriz CGH demonstrou ser uma abordagem específica e sensível na detecção de aberrações submicroscópicas.

Ao usar microarrays sobrepostos, também é possível descobrir pontos de interrupção envolvidos em aberrações cromossômicas.

Diagnóstico genético pré-natal

Embora ainda não seja uma técnica amplamente utilizada, o uso de CGH array como uma ferramenta para triagem genética pré-implantação está se tornando um conceito cada vez mais popular. Ele tem o potencial de detectar CNVs e aneuploidia em óvulos, espermatozóides ou embriões que podem contribuir para a falha do embrião em se implantar com sucesso, aborto espontâneo ou condições como a síndrome de Down (trissomia do cromossomo 21). Isso torna o array CGH uma ferramenta promissora para reduzir a incidência de condições que alteram a vida e melhorar as taxas de sucesso das tentativas de fertilização in vitro . A técnica envolve a amplificação de todo o genoma de uma única célula que é então usada no método CGH array. Também pode ser usado em casais que carregam translocações cromossômicas , como translocações recíprocas balanceadas ou translocações Robertsonianas, que têm o potencial de causar desequilíbrios cromossômicos em seus filhos.

Limitações de CGH e CGH de matriz

A principal desvantagem do CGH convencional é sua incapacidade de detectar aberrações cromossômicas estruturais sem alterações no número de cópias , como mosaicismo , translocações cromossômicas balanceadas e inversões . O CGH também pode detectar apenas ganhos e perdas em relação ao nível de ploidia. Além disso, as regiões cromossômicas com sequências curtas de DNA repetitivas são altamente variáveis ​​entre os indivíduos e podem interferir na análise de CGH. Portanto, regiões de DNA repetitivas como centrômeros e telômeros precisam ser bloqueadas com DNA repetitivo não marcado (por exemplo, DNA Cot1) e / ou podem ser omitidas da triagem. Além disso, a resolução do CGH convencional é um grande problema prático que limita suas aplicações clínicas. Embora o CGH tenha provado ser uma técnica útil e confiável na pesquisa e no diagnóstico de câncer e doenças genéticas humanas, as aplicações envolvem apenas anormalidades graves. Devido à resolução limitada dos cromossomos metafásicos, aberrações menores que 5–10 Mb não podem ser detectadas usando CGH convencional. Para a detecção de tais anormalidades, é necessária uma técnica de alta resolução. O Array CGH supera muitas dessas limitações. O array CGH é caracterizado por uma alta resolução, sua maior vantagem em relação ao CGH convencional. A resolução padrão varia entre 1 e 5 Mb, mas pode ser aumentada até aproximadamente 40 kb, complementando a matriz com clones extras. No entanto, como no CGH convencional, a principal desvantagem do CGH array é sua incapacidade de detectar aberrações que não resultam em alterações no número de cópias e é limitado em sua capacidade de detectar mosaicismo. O nível de mosaicismo que pode ser detectado depende da sensibilidade e resolução espacial dos clones. Atualmente, rearranjos presentes em aproximadamente 50% das células são o limite de detecção. Para a detecção de tais anomalias, outras técnicas, como SKY (cariotipagem espectral) ou FISH, ainda devem ser utilizadas.

Veja também

Referências

links externos